1. Eerste inzicht

In dit stadium moeten we enkele concepten en terminologie begrijpen, om te voorkomen dat we fouten maken waar onze senioren bij zijn, zoals:

V: Wat is het verschil tussen RT-PCR, qPCR, real-time PCR en real-time RT-PCR?

Antwoord: RT-PCR is reverse transcriptie PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR), een veelgebruikte variant van de polymerasekettingreactie (PCR).Bij RT-PCR wordt een RNA-streng omgekeerd getranscribeerd in complementair DNA, dat vervolgens wordt gebruikt als een sjabloon voor DNA-amplificatie door PCR.
Realtime-PCR en qPCR(Quantitative Realtime-PCR) zijn hetzelfde, beide zijn real-time kwantitatieve PCR, wat betekent dat elke PCR-cyclus real-time gegevensrecords heeft, zodat het aantal startsjablonen nauwkeurig kan worden geanalyseerd.

Hoewel zowel real-time PCR (real-time fluorescente kwantitatieve PCR) als reverse transcription PCR (reverse transcription PCR) lijken te worden afgekort als RT-PCR, is de internationale conventie: RT-PCR verwijst specifiek naar reverse transcriptiePCR, Real-time PCR wordt over het algemeen afgekort als qPCR (kwantitatieve real-time PCR).

En real-time RT-PCR (RT-qPCR), het is de reverse transcriptie-PCR gecombineerd met de fluorescerende kwantitatieve technologie: verkrijg eerst cDNA (RT) van RNA reverse transcriptie en gebruik vervolgens real-time PCR voor kwantitatieve analyse (qPCR).De meeste laboratoria doen aan RT-qPCR, dat wil zeggen onderzoek naar RNA-expressie-downregulatie, dus de qPCR waar iedereen in het laboratorium over praat, verwijst eigenlijk naar RT-qPCR, maar vergeet niet dat er nog steeds veel DNA-testen in klinische toepassingen zijn.Kwantitatieve analyse, zoals detectie van hepatitis B-virus HBV.

Vraag: Waarom zou het geamplificeerde fragment na het lezen van veel fluorescerende kwantitatieve PCR binnen het bereik van 80-300 bp moeten worden gecontroleerd?

Antwoord: De lengte van elke gensequentie is anders, sommige zijn enkele kb, sommige zijn honderden bp, maar we hoeven alleen te eisen dat de productlengte 80-300 bp is bij het ontwerpen van primers, te kort of te lang zijn niet geschikt voor fluorescerende kwantitatieve PCR-detectie.Het productfragment is te kort om te onderscheiden van het primer-dimeer.De lengte van het primer-dimeer is ongeveer 30-40 bp en het is moeilijk te onderscheiden of het een primer-dimeer is of een product als het minder dan 80 bp is.Als het productfragment te lang is, meer dan 300 bp, zal dit gemakkelijk leiden tot een lage amplificatie-efficiëntie en kan de hoeveelheid van het gen niet effectief worden gedetecteerd.

Als je bijvoorbeeld telt hoeveel mensen er in een klas zitten, hoef je alleen maar te tellen hoeveel monden er zijn.Hetzelfde geldt wanneer je genen detecteert, je hoeft alleen maar een bepaalde sequentie van een gen te detecteren om de hele sequentie weer te geven.Als je mensen wilt tellen, moet je zowel monden als neuzen, oren en brillen tellen, en het is gemakkelijk om fouten te maken.

Om uit te breiden, in biologisch onderzoek zijn er veel onderzoeksgevallen van punt tot gebied, omdat de gensequentie van elke soort erg lang is, is het niet nodig en onmogelijk om alle fragmenten te meten, zoals bacteriële 16S-sequencing, dat is het uitvoeren van de conservatieve sequentie van bacteriën Assays om het aantal van een bepaalde populatie bacteriën af te leiden.

Vraag: Wat is de optimale lengte voor het ontwerpen van qPCR-primers?

Antwoord: Over het algemeen is de primerlengte ongeveer 20-24 bp, wat beter is.Natuurlijk moeten we bij het ontwerpen van de primer letten op de TM-waarde van de primer, omdat deze gerelateerd is aan de optimale gloeitemperatuur.Na veel experimenteren is bewezen dat 60°C een betere TM-waarde is.Als de gloeitemperatuur te laag is, zal dit gemakkelijk leiden tot niet-specifieke amplificatie.Als de gloeitemperatuur te hoog is, zal de versterkingsefficiëntie relatief laag zijn, zal de piek van de versterkingscurve later beginnen en zal de CT-waarde worden vertraagd.

Vraag: Hoe verschilt de kleurstofmethode van de sondemethode?

Antwoord: KleurstofmethodeSommige fluorescerende kleurstoffen, zoals SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, enz., zenden zelf geen licht uit, maar zullen fluorescentie uitzenden na binding aan de kleine groef van dubbelstrengig DNA.Daarom kan de machine aan het begin van de PCR-reactie het fluorescerende signaal niet detecteren.Wanneer de reactie de annealing-extensiefase bereikt, wordt de dubbele streng geopend en wordt een nieuwe streng gesynthetiseerd onder invloed van DNA-polymerase, en bindt het fluorescerende molecuul zich aan de dsDNA-kleine groef.Naarmate het aantal PCR-cycli toeneemt, worden steeds meer kleurstoffen gecombineerd met dubbelstrengs DNA en wordt het fluorescerende signaal ook continu verbeterd.De kleurstofmethode wordt voornamelijk gebruikt in wetenschappelijk onderzoek.
PS: Wees voorzichtig bij het uitvoeren van het experiment, de kleurstof moet worden gecombineerd met menselijk DNA, wees voorzichtig om er een fluorescerend persoon van te maken.

Verfmethode (links) Sondemethode (rechts)
PS: Wees voorzichtig bij het uitvoeren van het experiment, de kleurstof moet worden gecombineerd met menselijk DNA, wees voorzichtig om er een fluorescerend persoon van te maken.

SYBR Green Ⅰ bindt zich aan de kleine groef van het DNA

Sonde methodeDe Taqman-sonde is de meest gebruikte hydrolyse-sonde.Er is een fluorescerende groep aan het 5'-uiteinde van de sonde, meestal FAM, en de sonde zelf is een sequentie die complementair is aan het doelgen.Er is een fluorescerende dovende groep aan het 3'-uiteinde.Volgens het principe van fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (Förster-resonantie-energieoverdracht, FRET), wanneer de reporter-fluorescerende groep (donor-fluorescerend molecuul) en de dovende fluorescerende groep (acceptor-fluorescerend molecuul) worden opgewonden. Wanneer de spectra elkaar overlappen en de afstand zeer dichtbij is (7-10nm), kan de excitatie van het donormolecuul de fluorescentie van het acceptormolecuul induceren, terwijl de autofluorescentie wordt verzwakt.Daarom zal aan het begin van de PCR-reactie, wanneer de sonde vrij en intact is in het systeem, de fluorescerende reportergroep geen fluorescentie uitzenden.Bij het uitgloeien binden de primer en de sonde aan de sjabloon.Tijdens de uitbreidingsfase synthetiseert het polymerase continu nieuwe ketens.DNA-polymerase heeft 5'-3'-exonuclease-activiteit.Bij het bereiken van de sonde zal de DNA-polymerase de sonde hydrolyseren van de sjabloon, de reporter-fluorescentiegroep scheiden van de quencher-fluorescentiegroep en het fluorescentiesignaal vrijgeven.Aangezien er een één-op-één-relatie is tussen de sonde en de sjabloon, is de sondemethode superieur aan de kleurstofmethode wat betreft de nauwkeurigheid en gevoeligheid van de test.De sondemethode wordt voornamelijk gebruikt bij de diagnose.

Vraag: Wat is absolute kwantificering?Wat is relatieve kwantificering?

Antwoord: Absolute kwantificering verwijst naar de berekening van het initiële aantal kopieën van het monster dat moet worden getest door qPCR, zoals hoeveel HBV-virussen er in 1 ml bloed zitten.Het resultaat dat wordt verkregen door relatieve kwantificering is de verandering in de hoeveelheid van het doelgen in een specifiek monster ten opzichte van een ander referentiemonster, en de genexpressie wordt omhoog of omlaag gereguleerd.

V: Zal ​​de hoeveelheid RNA-extractie, reverse transcriptie-efficiëntie en amplificatie-efficiëntie de experimentele resultaten beïnvloeden?
V: Zullen monsteropslag, extractiereagentia, reverse transcriptiereagentia en lichtdoorlatende verbruiksartikelen de experimentele resultaten beïnvloeden?
Vraag: Welke methode kan de experimentele gegevens corrigeren?

Met betrekking tot deze problemen zullen we ze in detail beschrijven in de geavanceerde en geavanceerde secties hieronder.
2. Gevorderde kennis

Met betrekking tot real-time fluorescerende kwantitatieve PCR moeten we erkennen dat er elk jaar duizenden wetenschappelijke onderzoeksdocumenten worden gepubliceerd, waarvan de fluorescerende kwantitatieve PCR-technologie geen klein aantal is.

Als er geen gemeenschappelijke standaard is om het fluorescerende kwantitatieve PCR-experiment te meten, kunnen de resultaten sterk variëren.Voor hetzelfde gen van dezelfde soort, met dezelfde verwerkingsmethode, zullen de detectieresultaten ook sterk variëren en zal het voor laatkomers moeilijk zijn om dezelfde resultaten te herhalen.Jij Niemand weet wat goed en wat fout is.

Betekent dit dat fluorescente kwantitatieve PCR een cheat-technologie of een onbetrouwbare technologie is?Nee, het is omdat fluorescerende kwantitatieve PCR gevoeliger en nauwkeuriger is, en een beetje verkeerde bediening zal volledig tegenovergestelde resultaten opleveren.Een klein verlies is duizend mijl ver weg.De auteur van het artikel kan herhaaldelijk worden gemarteld door de recensenten.Tegelijkertijd is het voor de recensenten van het tijdschrift ook moeilijk kiezen uit verschillende experimentele resultaten.

Al met al wijst dit op een gebrek aan consensus in real-time PCR-experimenten.Daartoe begonnen senior wetenschappers in de industrie normen te formuleren,bijdragers verplichten om enkele noodzakelijke experimentele en gegevensverwerkingsdetails (inclusief noodzakelijke gegevens) in het artikel te verstrekken om aan deze normen te voldoen.

Recensenten kunnen de kwaliteit van het experiment beoordelen door deze details te lezen;toekomstige lezers kunnen dit ook gebruiken om het experiment te herhalen of het experiment te verbeteren.Dan zijn de op deze manier verkregen experimentele resultaten vol informatie, van hoge kwaliteit en bruikbaar.

MIBBI (Minimale informatie voor biologische en biomedische onderzoeken -http://www.mibbi.org) is ontstaan.MIBBI is een project dat standaarden biedt voor experimenten.Het wordt in de natuur gepubliceerd.Dit project is gericht op verschillende biologische experimenten, waaronder celbiologie, Microarray, qPCR die we nu gaan bespreken, enz., en voorziet in elk type experiment bij het indienen van manuscripten.Die informatie moet te allen tijde worden verstrekt.

In het MIBBI-project zijn er twee artikelen met betrekking tot fluorescente kwantitatieve PCR, namelijk:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – een gestructureerde taal en rapportagegids voor real-time kwantitatieve PCR-gegevens;
·MIQE (Minimuminformatie voor publicatie van kwantitatieve real-time PCR-experimenten) – minimale informatie voor het publiceren van artikelen over real-time kwantitatieve PCR-experimenten.
Laten we het eerst hebben over RDML, de terminologiespecificatie.

Als er niet voor alles een standaarddefinitie is, is het onmogelijk om de discussie voort te zetten, daarom is de uitleg van termen zo belangrijk in het examen.
De terminologie die wordt gebruikt in het fluorescerende kwantitatieve PCR-experiment omvat de volgende inhoud.QIAGEN heeft voor ons de beste samenvatting gemaakt.De volgende zijn allemaal drooggoederen .

Versterkingscurve
De amplificatiecurve verwijst naar de curve gemaakt tijdens het PCR-proces, met het cyclusnummer als de abscis en de real-time fluorescentie-intensiteit tijdens de reactie als de ordinaat.

Een uitstekende versterkingscurve moet de volgende kenmerken hebben: de basislijn is vlak of licht verlaagd en er is geen duidelijke opwaartse trend;het buigpunt van de curve is duidelijk en de helling van de exponentiële fase is evenredig met de versterkingsefficiëntie.Hoe groter de helling, hoe hoger de versterkingsefficiëntie;de algehele versterkingscurve De parallelliteit is goed, wat aangeeft dat de versterkingsefficiëntie van elke buis vergelijkbaar is;de exponentiële fase van de amplificatiecurve van monsters met een lage concentratie is duidelijk.

Basislijn (basislijn)
De basislijn is het geluidsniveau van de vroege cyclus, meestal gemeten tussen de 3e en 15e cyclus, omdat de toename van de fluorescentiewaarde veroorzaakt door het amplificatieproduct tijdens deze periode niet kan worden gedetecteerd.Het aantal cycli dat wordt gebruikt om de basislijn te berekenen, kan worden gevarieerd en moet mogelijk worden verminderd als grote hoeveelheden template worden gebruikt of als het expressieniveau van het doelgen hoog is.

Voor het instellen van de basislijn moeten de fluorescentiegegevens van de lineariteitsamplificatiecurve worden bekeken.De basislijn wordt zo ingesteld dat de groei van de amplificatiecurve begint met een cyclusnummer dat groter is dan het hoogste nummer van de basislijncyclus.Basislijnen moeten voor elke doelreeks afzonderlijk worden ingesteld.De gemiddelde fluorescentiewaarden die in de vroege cycli worden gedetecteerd, moeten worden afgetrokken van de fluorescentiewaarden die in de geamplificeerde producten worden verkregen.De nieuwste versies van verschillende Real-Time PCR-software maken automatische optimalisatie van basislijninstellingen voor individuele monsters mogelijk.

Tijdens de eerste paar cycli van de PCR-amplificatiereactie verandert het fluorescentiesignaal niet veel.Het naderen van een rechte lijn wordt de basislijn genoemd, maar als we goed kijken naar de eerste paar cycli, zien we dat binnen de basislijn gebeurt wat er in de onderstaande afbeelding gebeurt.

Achtergrond Achtergrond verwijst naar
de niet-specifieke fluorescentiewaarde in de reactie.Bijvoorbeeld: inefficiënte uitdoving van fluorescentie;of een groot aantal dubbelstrengige DNA-templates door het gebruik van SYBR Green.De achtergrondcomponenten van het signaal worden wiskundig verwijderd door het Real-Time PCR-softwarealgoritme.

Verslaggever signaal
Reportersignaal verwijst naar het fluorescerende signaal dat wordt gegenereerd door SYBR Green of fluorescerend gelabelde sequentiespecifieke sondes tijdens real-time PCR.

Genormaliseerd Reporter-signaal (RN)
RN verwijst naar de fluorescentie-intensiteit van de reporterkleurstof gedeeld door de fluorescentie-intensiteit van de passieve referentiekleurstof gemeten bij elke cyclus.

Passieve referentiekleurstof
In sommige real-time PCR's,de fluorescerende kleurstof ROX wordt gebruikt als interne referentie om het fluorescerende signaal te normaliseren.Het corrigeert per putje voor variaties als gevolg van onnauwkeurig pipetteren, well-positie en fluorescentiefluctuaties.

De fluorescentiedrempel (threshold)
werd aangepast boven de achtergrondwaarde en aanzienlijk onder de plateauwaarde van de amplificatiecurve.Het moet in het lineaire gebied van de amplificatiecurve liggen, wat het log-lineaire bereik van PCR-detectie vertegenwoordigt.Drempels moeten worden ingesteld in de weergave van de log-amplificatiecurve, zodat de log-lineaire fase van PCR gemakkelijk kan worden geïdentificeerd.Als er meerdere doelwitgenen zijn in real-time PCR, moet de drempel voor elk doelwit worden ingesteld.Over het algemeen wordt het fluorescentiesignaal van de eerste 15 cycli van PCR-reactie gebruikt als het fluorescentie-achtergrondsignaal en is de fluorescentiedrempel 10 keer de standaarddeviatie van het fluorescentiesignaal van de eerste 3 tot 15 PCR-cycli, en wordt de fluorescentiedrempel ingesteld in de exponentiële fase van PCR-amplificatie.Over het algemeen wordt voor elk instrument de fluorescentiedrempel ingesteld voor gebruik.

Cyclusdrempel (CT) of Crossing Point (CP)
De cyclus waarbij de amplificatiecurve de drempel overschrijdt (dwz het punt waarop fluorescentiedetectie aanzienlijk toeneemt).CT kan een fractie zijn en de hoeveelheid startsjabloon kan worden berekend.De CT-waarde vertegenwoordigt het aantal cycli dat wordt ervaren wanneer het fluorescerende signaal in elke PCR-reactiebuis de ingestelde drempel bereikt.Er is een lineair verband tussen de CT-waarde van elke sjabloon en de logaritme van het eerste kopienummer van de sjabloon, dehoe hoger het oorspronkelijke kopienummer, hoe kleiner de CT-waarde, en vice versa.Een standaardkromme kan worden gemaakt door gebruik te maken van een standaard met een bekend initieel aantal kopieën, waarbij de abscis de CT-waarde vertegenwoordigt en de ordinaat de logaritme van het initiële kopienummer vertegenwoordigt.Daarom kan, zolang de CT-waarde van het onbekende monster wordt verkregen, het eerste kopienummer van het monster worden berekend op basis van de standaardcurve.

ΔCT-waarde
ΔCT-waarde beschrijfthet verschil tussen het doelgen en de corresponderende CT-waarde van het endogene referentiegen, zoals een huishoudgen, en wordt gebruikt om de hoeveelheid gebruikte sjabloon te normaliseren:
⇒ΔCT = CT (doelgen) – CT (endogeen referentiegen)

ΔΔCT-waarde
De ΔΔCT-waarde beschrijft het verschil tussen de gemiddelde ΔΔCT-waarde van een interessant monster (bijv. gestimuleerde cellen) en de gemiddelde ΔΔCT-waarde van een referentiemonster (bijv. niet-gestimuleerde cellen).Het referentiemonster wordt ook wel het kalibratiemonster genoemd en alle andere monsters worden hierop genormaliseerd voor relatieve kwantificering:
⇒ΔΔCT = gemiddelde ΔCT (interessemonster) – gemiddelde ΔCT (referentiemonster)

Endogene referentiegenen (endogene referentiegenen)
De expressieniveaus van endogene referentiegenen, zoals huishoudgenen (huishoudgenen), verschillen niet tussen monsters.Door de CT-waarden van het referentiegen te vergelijken met het doelwitgen kan het expressieniveau van het doelwitgen worden genormaliseerd naar de hoeveelheid input-RNA of cDNA (zie het gedeelte over ΔCT-waarden hierboven).

Interne referentiegenen corrigeren voormogelijke RNA-afbraak of de aanwezigheid van enzymremmers in RNA-monsters, evenals variaties in RNA-inhoud, reverse transcriptie-efficiëntie, nucleïnezuurterugwinning en monsterbehandeling.Om de optimale referentiegen(en) te selecteren, hebben we het algoritme aangepast om de selectie van de optimale referentie mogelijk te maken, afhankelijk van de experimentele setting.

Interne controle
Een controlesequentie die wordt geamplificeerd in dezelfde reactie als de doelsequentie en wordt geprobed met een andere probe (dwz het uitvoeren van duplex-PCR).Interne controles worden vaak gebruikt om mislukte amplificaties uit te sluiten, bijvoorbeeld wanneer de doelsequentie niet wordt gedetecteerd.
Kalibratie monster
Een referentiemonster (bijvoorbeeld gezuiverd RNA uit een cellijn of weefsel) dat wordt gebruikt bij relatieve kwantificering om alle andere monsters te vergelijken om het relatieve expressieniveau van een gen te bepalen.Het kalibratiemonster kan elk monster zijn, maar is meestal een controlemonster (bijvoorbeeld een onbehandeld monster of een monster vanaf tijdstip nul van het experiment).

Positieve controles
gebruik controlereacties metbekende hoeveelheden sjabloon.Positieve controles worden vaak gebruikt om te controleren of een primerset of primer-sondeset correct werkt en of de reactie correct is ingesteld.

Geen sjablooncontrole (NTC)
Een controlereactie die alle benodigde componenten van de amplificatiereactie bevat, behalve de template, die meestal wordt vervangen door water.Het gebruik van NTC kan de verontreiniging vinden die wordt veroorzaakt door reagensverontreiniging of vreemd DNA, waardoor de authenticiteit en betrouwbaarheid van de detectiegegevens wordt gegarandeerd.Versterking van de NTC-controle wijst op verontreiniging.

Geen RT-regeling (NRT)
Het RNA-extractieproces kan achtergebleven genomisch DNA bevatten, wat buitengewoon schadelijk is en de boosdoener is die de gegevenskwaliteit en de natuurlijke vijand van qPCR beïnvloedt, dus bij het ontwerpen van experimenten moet het worden ontworpen om alleen RNA-detectie te versterken.Er zijn twee manieren, de ene is om primers over introns heen te ontwerpen, de andere is om DNA volledig te verwijderen, welke beter is, wat later zal worden besproken.De NTR-controle is een magische spiegel om DNA-verontreiniging op te sporen.Als er versterking is, betekent dit dat er vervuiling is.

Normen
Standaarden zijn monsters met een bekende concentratie of kopienummer die worden gebruikt om een ​​standaardcurve te construeren.Om de stabiliteit van de standaard te waarborgen, wordt het genfragment gewoonlijk in het plasmide gekloneerd en als standaard gebruikt.

De standaardkromme
wordt gewoonlijk verdund in ten minste 5 concentratiegradiënten met het standaardproduct volgens de verdubbelingsverhouding, en 5 punten worden getekend in de coördinaten van CT-waarde en kopienummer, en de punten worden verbonden om een ​​lijn te vormen om een ​​standaardkromme te genereren.Voor elke standaardcurve moet de geldigheid ervan worden gecontroleerd.De hellingswaarde valt tussen –3,3 en –3,8 en elke concentratie wordt in drievoud uitgevoerd.Punten die aanzienlijk verschillen van andere punten moeten worden weggegooid.De CT-waarde van het te testen monster wordt in de standaardcurve gebracht en het expressieniveau van het te testen monster kan worden berekend.

De CT-waarde van het te testen monster wordt in de standaardcurve gebracht en het eerste aantal kopieën van het te testen monster kan worden berekend.

Efficiëntie en helling
De helling van de standaardcurve vertegenwoordigt de efficiëntie van real-time PCR.
·Een helling van -3,322 geeft aan dat de efficiëntie van de PCR-amplificatie 1 is, ofwel 100% efficiënt, en dat de hoeveelheid PCR-product bij elke cyclus verdubbelt.
·Een helling van minder dan –3,322 (bijv. –3,8) duidt op een PCR-efficiëntie
·Een helling groter dan –3,322 (bijv. –3,0) geeft aan dat de PCR-efficiëntie groter lijkt te zijn dan 100%, wat merkwaardig is: hoe kan één PCR-cyclus meer dan het dubbele van het geamplificeerde product genereren?Deze situatie doet zich voor in de niet-lineaire fase van de PCR-reactie, dat wil zeggen dat er een grote hoeveelheid niet-specifieke amplificatie is.

smeltkromme
Nadat de qPCR-amplificatie is voltooid, wordt het PCR-product verwarmd.Naarmate de temperatuur stijgt, smelt het dubbelstrengs amplificatieproduct geleidelijk, wat resulteert in een afname van de fluorescentie-intensiteit.Bij het bereiken van een bepaalde temperatuur (Tm) zal een groot aantal producten smelten.Fluorescentie daalt sterk.Verschillende PCR-producten hebben verschillende Tm-waarden en verschillende smelttemperaturen, zodat de specificiteit van PCR kan worden geïdentificeerd.

Smeltkromme (afgeleide kromme)
De smeltkromme wordt afgeleid om een ​​piekkaart te vormen, die de situatie van PCR-productfragmenten intuïtiever kan weergeven.Aangezien de smelttemperatuur de Tm-waarde van het DNA-fragment is, kunnen sommige parameters die van invloed zijn op de Tm-waarde van het DNA-fragment worden beoordeeld, zoals fragmentgrootte, GC-gehalte, enz. In het algemeen, volgens onze primerontwerpprincipes,de lengte van het geamplificeerde product ligt in het bereik van 80-300 bp, dus de smelttemperatuur moet tussen 80°C en 90°C liggen.

Interpretatie van de smeltkromme: Als de enige hoofdpiek verschijnt tussen 80°C-90°C, betekent dit dat de fluorescerende kwantitatieve PCR perfect is;als de hoofdpiek verschijnt tussen 80°C-90°C en diverse pieken verschijnen onder 80°C, wordt in principe het primerdimeer beschouwd.U kunt proberen de gloeitemperatuur te verhogen om het op te lossen;als de hoofdpiek verschijnt tussen 80°C-90°C, en de diverse piek verschijnt weer wanneer de temperatuur stijgt, wordt er in principe van uitgegaan dat er sprake is van DNA-besmetting en moet DNA worden verwijderd in de beginfase van het experiment.

Natuurlijk zijn er nog enkele abnormale situaties, die hieronder één voor één worden uitgesplitst.
3. Gevorderde kennis

Om qPCR te doen, moet ik MIQE zeggen,Minimale informatievoor publicatie vanKwantitatiefRealtime PCRExperimenten —de minimale informatie voor het publiceren van artikelen over real-time kwantitatieve PCRexperimenten.Om het begrip voor iedereen te vereenvoudigen, zullen we de belangrijkste inhoud vereenvoudigen.

U kunt de originele tekst van MIQE op internet doorzoeken, en het belangrijkste is dat het degegevenschecklist die moet worden verstrekt bij het publiceren van een artikel .

Recensenten kunnen de kwaliteit van het experiment beoordelen door deze details te lezen;toekomstige lezers kunnen dit ook gebruiken om het experiment te herhalen of te verbeteren.
Het is vermeldenswaard dat in deze lijst het belang van elke lijst respectievelijk is gemarkeerd met E of D.Wat betekent het?E: essentiële informatie (moet worden overgelegd);D: wenselijke informatie (zoveel mogelijk verstrekken).

MIQE (1)—Experimenteel ontwerp
Veel klootzakken die hun verdediging hebben voltooid na het afronden van hun afstudeerstudie, zullen niet weten hoe ze zelfstandig een experiment moeten ontwerpen, hun notitieboekjes moeten openen en doen wat de leraar hen zegt te doen.Als gevolg hiervan was de experimentele opzet niet rigoureus en de redactie van het tijdschrift zei dat ze deze foto en die foto wilden verzinnen, dus deden ze het in een roes.Zo worden de klootzakken gemaakt!

Dichter bij huis is bepalen het eerste principe van het experimentde strengheid van de experimentele logica.Het meest fundamentele is het experimentele ontwerp, en het belangrijkste aan het experimentele ontwerp is hoe het doelmonster, het referentiemonster (controle) en het aantal herhalingen worden ingesteld, zodat naar de experimentele gegevens kan worden verwezen, vergelijkbaar en overtuigend.

Het doelmonsterverwijst naar het monster dat vereist dat we het doelgen na een bepaalde behandeling detecteren.Het referentiemonsteris het monster zonder enige behandeling, waarnaar in de biologie vaak wordt verwezen als wildtype.

Experimentele replica'szijn erg belangrijk.Over het algemeen moet het aantal overtuigende herhalingen meer dan drie zijn.Het is noodzakelijk om te onderscheiden wat biologische replicatie is en wat technische replicatie is.

Biologische Replica's: Hetzelfde verificatie-experiment gedaan met verschillende materialen (tijd, planten, batches, reactieplaten).

Biologische duplicatie
Laten we de behandeling met pesticiden van peper als voorbeeld nemen.We willen pesticiden spuiten op de drie planten van ABC, dan zijn de drie planten van ABC drie biologische replica's, en ze zijn hetzelfde verificatie-experiment uitgevoerd met verschillende materialen.Maar als experiment is er zeker een controle nodig, dus we kunnen een van de takken van plant A besproeien om een ​​experimentele groep van plant A te vormen, en niet de andere takken van plant A besproeien om een ​​controlegroep te vormen.Doe hetzelfde voor B en C.

Technische Replica's (Technische Replica's): Het is een herhaald experiment dat is ontworpen om fouten veroorzaakt door bediening te voorkomen, wat eigenlijk een dubbel gat is in hetzelfde materiaal.Zowel behandelingen als controles moeten replicatie-instellingen hebben (minimaal drie) van het doelgen en het interne referentiegen.

Technische herhaling
Neem de met bestrijdingsmiddelen behandelde paprika weer als voorbeeld.Voor de experimentele groep van plant A hebben we drie PCR-gaten van 1, 2 en 3 gemaakt voor respectievelijk het doelgen en het interne referentiegen, om het gemiddelde te nemen na de detectie.Voor de bestrijding van plant A worden ook groepen op dezelfde manier behandeld.Voer op dezelfde manier dezelfde behandeling uit voor B- en C-planten.Dit is technische herhaling.

Het is vermeldenswaard datwat in de statistieken komt, is de biologische herhaling, en de technische herhaling is om te testen of er willekeurige verschijnselen in het experimentele proces zijn, om de experimentele resultaten geloofwaardig te maken, dat wil zeggen om fouten te voorkomen door hun gemiddelde te nemen, zoals we vaak zeggen.

Negatieve controles - NTC en NRT
NTC (controle zonder sjabloon), een controle zonder sjabloon, wordt gebruikt om te verifiëren of het experimentele materiaal besmet is.Over het algemeen wordt water als sjabloon gebruikt.Als er een fluorescerende reactie is, geeft dit aan dat er nucleïnezuurverontreiniging is opgetreden in het laboratorium.

Deze vervuilingen zijn afkomstig van: onzuiver water, niet-gekwalificeerde reagentia die endogeen DNA bevatten, primervervuiling, vervuiling van laboratoriumapparatuur, aerosolvervuiling, enz., moeten RNase-scavengers en RNase-remmers gebruiken.Aerosolverontreiniging is het moeilijkst te vinden.Stel je voor dat je laboratorium als smog is, met verschillende nucleïnezuren in de lucht.

NRT (No-Reverse Transcriptase), de controle zonder reverse transcriptie, is het niet-reverse getranscribeerde RNA als een negatieve controle, wat de controle is van gDNA-residu.

Bij genexpressie wordt de hoeveelheid RNA gedetecteerd door de hoeveelheid cDNA te detecteren na reverse transcriptie.Als er gDNA-residu is wanneer RNA wordt gezuiverd, veroorzaakt dit fouten in de experimentele resultaten, omdat de feitelijk verkregen resultaten gDNA en cDNA zijn.Op aggregaatniveau, niet alleen cDNA, moet gDNA volledig worden verwijderd tijdens RNA-extractie.

MIQE (2)—voorbeeldinformatie
De zogenaamde voorbeeldinformatie houdt in dat wanneer we een artikel over qPCR publiceren, we de voorbeeldinformatie duidelijk moeten uitleggen, wat een onmisbaar onderdeel van het artikel is.Evenzo moeten we, wanneer we monsters verwerken, ook onze eigen activiteiten reguleren om de geldigheid van de monsters te waarborgen.

De beschrijving van het monster is slechts een resultaat en we zouden tijdens het hele experiment meer aandacht moeten besteden aan de materialen die zijn genomen.

Selectie van experimentele materialen
Bloedmonsters - kies vers bloed, niet meer dan 4 uur.Celmonsters - kies ervoor om verse cellen te verzamelen in een periode van krachtige groei.Dierlijk weefsel - Kies vers, krachtig groeiend weefsel.Plantenweefsel - Kies vers, jong weefsel.

Het is je vast opgevallen dat er een sleutelwoord in deze paar zinnen zit: vers.
Voor de bovenstaande monsters is de beste, kosteneffectieve en stabiele kit op de markt de kit van Foregene, die snel en gemakkelijk hun DNA en RNA kan extraheren.

Bloed-DNA-minikit

Cell Total RNA-isolatiekit

Animal Total RNA-isolatiekit

Plant Total RNA-isolatiekit

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Planten-DNA-isolatiekit

Opslag van experimenteel materiaal
Over het algemeen raden we af om monsters op te slaan als de omstandigheden dit toelaten.Er zijn echter veel vrienden die niet direct na het bemonsteren experimenten kunnen uitvoeren, en sommigen moeten zelfs tanks met vloeibare stikstof naar het veld dragen voor bemonstering.

Voor dit soort hardwerkende vriend kan ik alleen maar zeggen dat je verbruiksartikelen voor reagentia niet begrijpt.Nu produceren veel bedrijven voor verbruiksartikelen van reagentia reagentia die RNA-monsters bij kamertemperatuur kunnen opslaan, en u kunt ervoor kiezen om ze te gebruiken.De conventionele opslagmethode is de opslag van vloeibare stikstof, waarbij gebruik wordt gemaakt van een kleine tank met vloeibare stikstof die gemakkelijk mee te nemen is.Nadat u het monster naar het laboratorium hebt teruggebracht, bewaart u het in een koelkast van -80°C.

Voor experimenten met RNA moet het zeswoordenprincipe worden gevolgd:lage temperatuur, geen enzymen,Ensnel .

Het concept van lage temperatuur is gemakkelijk te begrijpen;zonder enzymen is RNase overal in de wereld waarin we leven (anders zou je zijn gedood door HIV), dus hoe je RNase kunt vermijden bij het doen van experimenten is een heel belangrijk concept;snel,Er is geen Kung Fu in de wereld die niet kan worden verbroken, alleen snelheid kan niet worden verbroken.

Daarom geldt in zekere zin: hoe korter de extractietijd, hoe beter de kit.Waarom doetForegene's kit legt de nadruk op snelheid, omdat ze die goed kennen.

PS: Sommige meisjes doen experimenten heel voorzichtig, maar ze zijn niet zo goed als een slam dunk na jaren van werk.Ze voelen dat God oneerlijk is, ze klagen over anderen en zijn op zoek naar het leven.Sterker nog, ze begreep het niet.Hij beschermde het RNA niet goed en de slam dunk-speler was behendig.Toen hij het experiment deed, dacht hij dat hij de slam dunk zou afmaken met drie keer, vijf keer en twee divisies, maar hij deed het experiment goed.

Opmerking: Langzamer, meer kans op RNase-invasie.Hoe train je jezelf om snel te zijn?Er is geen manier, gewoon meer oefenen.

Voor verschillende experimenten en verschillende monsters is het nog steeds nodig om meer literatuur te lezen en een geschikte verwerkingsmethode te kiezen.Voor het monsterverzamelings- en opslagproces vereist MIQE dat het duidelijk in het papier moet worden geschreven, zodat de recensenten de betrouwbaarheid van het papier kunnen beoordelen, en het is ook handig voor de verbijsterde jongeren om uw experiment te herhalen.

Hoewel biologische experimenten moeilijk zijn, zijn ze high-end.Als je niet oppast, kun je de wereld omverwerpen.Bijvoorbeeld van SARS een biochemische crisis maken, of hybride rijst maken om 1,3 miljard mensen te redden.De onderstaande afbeelding is een chemisch experiment, je zou moeten begrijpen hoe trots je bent op je onderzoek door alleen maar naar zijn lulachtige uiterlijk te kijken.Vergeet het maar, maak hem niet zwart.

MIQE (3) – extractie van nucleïnezuur.
Nucleïnezuurextractie is een groot evenement en alle moleculaire biologische experimenten beginnen met nucleïnezuurextractie.Laten we allereerst de inhoud van MIQE over nucleïnezuurextractie kopiëren.

Als je naar deze vorm kijkt, kun je niet aan de oppervlakte blijven.De vorm is een dogma.Om een ​​topstudent te zijn, moet je je afvragen waarom.De essentiële inhoud van deze tabel is: Strevende zuiverheid, integriteit, consistentie en extractiehoeveelheid van RNA .

Het eerste deel van deproces of instrument is de nucleïnezuurextractiestap.Als u een automatische nucleïnezuurextractor gebruikt om te extraheren (geavanceerd, neem dan contact met mij op voor aankoop), moet u de modelnaam van het instrument aangeven.

De naam van de kit en

welke kit is gebruikt voor de wijzigingsdetails, welke speciale reagentia zijn toegevoegd of welke speciale bewerkingen zijn uitgevoerd, moet duidelijk worden uitgelegd, zodat anderen uw experiment gemakkelijk kunnen herhalen.

Sommige mensen voegen een aantal speciale reagentia toe bij het extraheren van speciale monsters, denkend dat dit hun geheime wapen is en vertellen het niet aan anderen.Terwijl ze het geheim houden, verliezen ze ook de kans om uw artikel te laten schitteren.Wees niet slim, je moet eerlijker zijn dan de oude Zhang in wetenschappelijk onderzoek, als je slim wilt zijn, zal het artikel je dom maken.

moet het productnummer van de kit onthoudenwanneer u de kit bestelt en het artikel schrijft.Over het algemeen staan ​​er twee nummers op de kit: Cat—catalogusnummer (productnummer, artikelnummer), Lot—lotnummer van het product (gebruikt om aan te geven uit welke batch het product afkomstig is).

Bovendien wordt het CAS-nummer vaak gebruikt bij het bestellen van biochemische reagentia, en ik zal het samen populair maken.Het CAS-nummer is het nummer dat door de American Chemical Society aan elk nieuw chemisch geneesmiddel wordt gegeven.Over het algemeen zijn drie getallen verbonden door een streepje.CAS-nummer van Rushui: 7732-18-5.Chemicaliën hebben vaak meerdere aliassen, maar het CAS-nummer is uniek.Bij het bestellen van medicijnen kunt u eerst het CAS-nummer controleren.

Waarom moeten we dichter bij huis deze dingen duidelijk beschrijven?In feite is het ook om de kwaliteit van de RNA-extractie te controleren.Het gebruik van instrumenten en kits zal RNA-extractie consistenter maken.De extractieschaal van gewone laboratoria is niet groot en kan met kits worden verkregen.

De details van de DNase- of RNase-behandeling
De belangrijke kwestie van fluorescerende kwantitatieve PCR is om DNA-besmetting te voorkomen en niet te experimenteren als er besmetting is.Daarom is het absoluut noodzakelijk om het proces te vermelden dat u hebt gebruikt om het DNA te verwerken, om aan te tonen dat het DNA in het experimentele proces volledig en volledig is verwijderd.weergegeven door een schematisch diagram.

Schematisch diagram van RNA en DNA
Over het algemeen is de methode voor het verwijderen van DNA het behandelen van RNA met DNase na extractie.Dit zijn echter relatief oude methoden.Commerciële RNA-extractiekits hebben tijdens het extractieproces DNA kunnen verwijderen zonder DNase toe te voegen.Bijvoorbeeld een reeks kits van Foregene.

Opmerking: Het verwijderen van DNA tijdens RNA-extractie is een zeer gevaarlijk tweesnijdend zwaard, dat de operatietijd van RNA-extractie verlengt en het risico op RNA-degradatie vergroot.Kortom, het is een afweging tussen RNA-opbrengst en zuiverheid.

Bovendien is de hoeveelheid DNase die wordt toegevoegd aan de adsorptiekolom op silicabasis erg klein en moet DNase van hoge kwaliteit worden gebruikt om het effect te bereiken.Niet-geoptimaliseerde DNase kan niet snel en volledig worden verteerd.Dit is een test van het technische niveau van de handelaar.Natuurlijk zijn er nog meer rare verkopers die opscheppen dat DNA kan worden verwijderd zonder DNase.Men kan zeggen dat iedereen die opschept dat DNA volledig verwijderd kan worden zonder DNase een hooligan is.DNA is een relatief stabiele dubbelstrengige structuur en kan niet worden weggevaagd door alleen maar te praten en te lachen.

Besmettingsbeoordeling
beoordelingsmethode: elektroforesedetectie, 1% agarose, 6V/cm, 15min, laden 1-3 ul

Nucleïnezuur kwantitatieve analyse
wordt meestal gemeten met een UV-spectrofotometer.Laat me eerst de betekenis van de drie waarden van OD260, OD280 en OD230 populair maken.
·OD260nm: Het is de absorptiegolflengte van de hoogste absorptiepiek van nucleïnezuur, en de best gemeten waarde varieert van 0,1 tot 1,0.Zo niet, verdun of concentreer dan het monster om het binnen bereik te brengen.
·OD280nm: Het is de absorptiegolflengte van de hoogste absorptiepiek van eiwitten en fenolische stoffen.
·OD230nm: Het is de absorptiegolflengte van de hoogste absorptiepiek van koolhydraten.

Laten we het vervolgens hebben over de rol van elke indicator.Voor A260 kan het worden gebruikt om de opbrengst van nucleïnezuur te meten.Wanneer OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Voor zuiverheid moeten we kijken naar de verhoudingen die we vaak zien: OD260/280 en OD260/230.
·Puur DNA: OD260/280 is ongeveer gelijk aan 1,8.Als het groter is dan 1,9, geeft dit aan dat er RNA-vervuiling is, en als het minder is dan 1,6, geeft dit aan dat er eiwit- en fenolvervuiling is.
·Puur RNA: 1.7
·OD260/230: Of het nu om DNA of RNA gaat, de referentiewaarde is 2,5.Wanneer deze lager is dan 2,0 geeft dit aan dat er sprake is van vervuiling van suiker, zout en organisch materiaal.

RNA-integriteit

Het is erg belangrijk om de integriteit van RNA te meten.Over het algemeen is het nodig om een ​​RNA-denaturatiegel-experiment uit te voeren om te controleren of de helderheid tussen 28S- en 18S-RNA een tweevoudige relatie is.Wanneer de derde band 5S verschijnt, betekent dit dat het RNA begint af te breken, behalve voor ongewervelde dieren.

Gegevens voor RNA-kwaliteitsbeoordeling: Naast de bovenstaande tests zijn er ook enkele meer geavanceerde instrumenttesten op het gebied van RNA-integriteit, zoals de RQI-integriteitstest van het Experion automatische elektroforesesysteem, die kan detecteren of RNA onzichtbaar is afgebroken.

In wetenschappelijk onderzoek is fluorescerende kwantitatieve PCR een vergelijking tussen het doelgen en het interne referentiegen.Daarom is het primaire doel tijdens het bewaren van RNA-monsters, RNA-extractie, enz. Het waarborgen van de integriteit van RNA.

Hoe de integriteit van RNA de balans tussen het doelgen en het interne referentiegen beïnvloedt, kan gemakkelijk worden begrepen uit de onderstaande afbeelding.Degradatie zal leiden tot onvolledigheid van het gen, of het nu de onvolledigheid van het interne referentiegen is of de onvolledigheid van het doelgen, het zal een grote impact hebben op de gegevens.

Schematisch diagram van doelgen en referentiegen, mag niet waar zijn

Remmingstest (of de CT-waarde wordt onderdrukt bij hoge of lage concentratie of andere omstandigheden)

Als we deze figuur als voorbeeld nemen, zijn de Ct-waarden van de vijf curven als volgt.De verdeling van CT-waarden tussen de curven is ongelijk en de Ct-waarden worden vertraagd bij hoge en lage concentraties, wat het geval is bij PCR-remming.

Belangrijkste punt: tijdens het proces van RNA-extractie moeten we misvattingen laten varen en de juiste vaststellen.

Het verkeerde idee is: RNA-extractie streeft alleen naar de opbrengst, denkend dat hoe groter de verkregen hoeveelheid RNA, hoe beter.Als we kwantificeren en het aantal genen niet erg groot is, hebben we zelfs niet veel RNA nodig.De hoeveelheid RNA die je extraheert is meer dan genoeg.

Het juiste begrip is:RNA-extractie moet zuiverheid, integriteit en consistentie nastreven.Zuiverheid kan ervoor zorgen dat de daaropvolgende reverse transcriptie niet wordt geremd en dat de gegevens niet worden beïnvloed door DNA.Integriteit zorgt voor de balans tussen doelsequenties en interne referenties.Consistentie zorgt voor een stabiele belading van monsters.

MQE (4) – omgekeerde transcriptie
Misvatting: het nastreven van een hoger monstervolume.
Correct concept: Streef naar consistentie (stabiliteit), ongeacht de hoeveelheid geladen RNA, de efficiëntie van reverse transcriptie blijft consistent, zodat verschillen in cDNA echt verschillen in mRNA kunnen weerspiegelen.
We leggen dit proces uit met een schematisch diagram:

Schematisch diagram van reverse transcriptie-efficiëntie, klopt niet
Allereerst moeten we het verschil begrijpen tussen het omgekeerde transcriptieproces en het PCR-proces.PCR ondergaat meerdere verwarmings- en annealingprocessen en het doelfragment groeit exponentieel;terwijl reverse transcriptie dit proces niet heeft, kunnen we ons voorstellen dat reverse transcriptie in feite één-op-één is. Tijdens het replicatieproces worden zoveel mogelijk stukjes RNA

aangezien er zoveel stukjes cDNA-informatie kunnen worden verkregen, zou het nu moeten worden begrepen, omdat grote en kleine fragmenten omgekeerd zijn getranscribeerd en het onmogelijk is om op één fragment te focussen.En omdat de hoeveelheid RNA relatief klein is, is de verkregen hoeveelheid cDNA ook relatief klein, in tegenstelling tot PCR, dat een amplificatie-effect heeft, dus het is in principe onmogelijk te detecteren.

resultaten van cDNA-elektroforese
Ten tweede wordt reverse transcriptie idealiter één-op-één uitgevoerd, maar geen enkele reverse transcriptase van welk bedrijf dan ook kan dit effect bereiken.Kortom, de efficiëntie van de meeste reverse transcriptases schommelt tussen 30-50%.Als dit het geval is, hebben we liever een relatief stabiele reverse transcriptie-efficiëntie, wat we in de figuur willen zien: 3 RNA's krijgen 2 cDNA's, 6 RNA's krijgen 4 cDNA's, dus hoeveel monster er ook geladen is, de reverse transcriptie-efficiëntie is relatief stabiel.We willen niet de situatie zien waarin de efficiëntie van reverse transcriptie onstabiel is en hoge concentratie wordt geremd.

Dus, hoe te verifiëren of de reverse transcriptie-efficiëntie stabiel is?De methode is heel eenvoudig, u hoeft alleen maar een vergelijkingstest uit te voeren: de ene is reverse transcriptie in cDNA na dubbele verdunning van RNA, en de andere is dubbele verdunning na reverse transcriptie in cDNA, en doe dan qPCR om de verkregen helling te zien. Is het consistent.Als topstudent zou je het binnen enkele seconden moeten begrijpen.Zoals hieronder getoond:

Verdunning van RNA en cDNA om te testen of de efficiëntie van reverse transcriptie stabiel is
Omgekeerde transcriptase en kit
Hoe kan perfecte fluorescerende kwantitatieve PCR uitstekende reverse transcriptase en kit hebben.Reverse transcriptase is grofweg verdeeld in twee typen volgens de bron, AMV ofM-MLV, en hun prestaties zijn dezelfde als die in de tabel.

RNase H-activiteit
RNase H is Ribonuclease H, de Chinese naam is ribonuclease H, een endoribonuclease dat specifiek RNA in de DNA-RNA hybride keten kan hydrolyseren.RNase H kan de fosfodiësterbindingen in enkelstrengs of dubbelstrengs DNA of RNA niet hydrolyseren, dat wil zeggen, het kan enkelstrengs of dubbelstrengs DNA of RNA niet verteren.Vaak gebruikt bij de synthese van de tweede streng van cDNA.

Het is iets vreemds.We zeggen dat reverse transcriptase RNase H-activiteit heeft, niet dat reverse transcriptase RNase H bevat, en dat het misschien niet mogelijk is om RNase H van reverse transcriptase te scheiden, misschien vanwege de conformatie van bepaalde groepen in reverse transcriptase. Deze activiteit wordt veroorzaakt door de reverse transcriptase.

Daarom vermindert de RNase H-activiteit, ongeacht de hogere reverse transcriptie-efficiëntie van AMV, de opbrengst van cDNA.Natuurlijk zijn reagensfabrikanten constant bezig met het optimaliseren van hun producten om RNase H-activiteit in reverse transcriptase zoveel mogelijk te elimineren om de opbrengst van cDNA te verhogen.
Gloeitemperatuur

Secundaire structuur van RNA bij verschillende temperaturen
Zie de afbeelding hierboven voor de secundaire structuur van RNA bij verschillende temperaturen en gebruik de online tool mFold om de secundaire structuur van het doelfragment te bepalen onder specifieke temperatuur- en zoutconcentratieomstandigheden.Bij 55°C is de secundaire structuur van het RNA nog zeer complex, kan reverse transcriptase niet werken en kan de secundaire structuur pas bij 65°C volledig worden opgelost, terwijl de optimale temperatuur van AMV en M-MLV veel lager is dan deze temperatuur.
wat moeten we doen?De secundaire structuur is de complementaire koppeling van de matrijs zelf, wat leidt tot sterke competitie tussen de primer en reverse transcriptase en de matrijs, wat resulteert in een reeks problemen zoals lage E en slechte herhaalbaarheid.

wat moeten we doen?Verhoog alleen de gloeitemperatuur zoveel mogelijk.

Veel fabrikanten van reagentia verbeteren hun reverse transcriptase door middel van genetische manipulatie.Sommige verhogen de reactietemperatuur, zoals Jifan en Adelai, en sommige verwijderen de actieve groep van het RNase H-enzym om de affiniteit tussen het enzym en de RNA-template te verbeteren.Hoge affiniteit kan de secundaire structuur competitief uitpersen en soepel doorlezen, en ook de efficiëntie van reverse transcriptie aanzienlijk verbeteren.
Sleutelpunt: Reverse transcriptie is belangrijker om de consistentie van reverse transcriptie-efficiëntie na te streven (enzymen moeten niet alleen efficiënt maar ook stabiel zijn), in plaats van de hoeveelheid geladen monster, als het geen bijzonder grootschalige fluorescerende kwantitatieve PCR is, zal het helemaal niet mogelijk zijn.Meerdere cDNA's.
Verschillende fabrikanten hebben ook inspanningen geleverd om consistentie na te streven.De meeste bedrijven hebben nu bijvoorbeeld reverse transcriptie verpakt als een standaardkit voor de verkoop, wat een goede keuze is.
Foregene's RT Easy Series-kits bijvoorbeeld:

RT Easy I (Master premix voor eerste streng cDNA-synthesekit)

MIQE (5) - doelgeninformatie

De bovenstaande figuur legt het uit
1. Of dit gen effectief is voor herhaalde experimenten kan over het algemeen worden geverifieerd door herhaalde experimenten.
2. Gene-ID, weet je.
3. Genlengte, de totale lengte van het doelgen is zeker geen probleem.Zorg er bij het ontwerpen van primers voor dat de lengte van het amplicon tussen 80-200 bp ligt om een ​​betere amplificatie-efficiëntie te garanderen.
4. Sequence Blast-vergelijkingsinformatie, het doelgen moet worden vergeleken in de genenbank om niet-specifieke amplificatie te voorkomen.
5. Aanwezigheid van pseudogenen.Een pseudogen is een DNA-sequentie die lijkt op een normaal gen, maar zijn normale functie verliest.Het komt vaak voor in de multi-genfamilie van eukaryoten.Het wordt meestal weergegeven door ψ.Het is een niet-functionele genomische DNA-kopie in het genoom die sterk lijkt op de coderende gensequentie., worden over het algemeen niet getranscribeerd en hebben geen duidelijke fysiologische betekenis.
6. Positie van primers ten opzichte van exons en introns.In de beginjaren, toen we het probleem van DNA-besmetting oplosten, besteedden we vaak aandacht aan de posities van primers, exons en introns, en overwogen we over het algemeen om primers over introns heen te ontwerpen om DNA-amplificatie te voorkomen.Zie de onderstaande afbeelding: zwart staat voor introns, verschillende blauwtinten vertegenwoordigen exons, roze staat voor algemene primers en felrood staat voor intron-overspannende primers.

Schematisch, nooit waar
Wat een perfect plan lijkt dit, maar in feite zijn de trans-intron-primers in de meeste gevallen niet zo magisch als gedacht, en ze zullen ook niet-specifieke amplificatie veroorzaken.De beste manier om DNA-besmetting te voorkomen, is dus het volledig verwijderen van DNA.
7. Voorspelling van conformatie.Gebruik opnieuw dit voorbeeld en gebruik de online tool mFold om de secundaire structuur van het doelfragment te bepalen bij een specifieke temperatuur en zoutconcentratie.

Secundaire structuur van RNA bij verschillende temperaturen
De secundaire structuur is de complementaire koppeling van de matrijs zelf, wat zal leiden tot sterke competitie tussen de primer- en matrijsparing, en de kans op primerbinding is kleiner, wat resulteert in een reeks problemen zoals lage E en slechte herhaalbaarheid.Door middel van softwarevoorspelling zou dat geweldig zijn als er geen probleem met de secundaire structuur is.Als dat het geval is, zal in ons vervolgartikel specifiek worden besproken hoe dit probleem kan worden opgelost.

MIQE (6)—qPCR-oligonucleotiden

Voor fluorescerende kwantitatieve PCR is het eerste waar je elke dag mee worstelt RNA-extractie, en het tweede kan het ontwerp van de primer zijn.
Allereerst controleren we nog steeds de regels over primerontwerp volgens de MIQE-checklist.Het is zo eenvoudig dat de klootzakken kunnen lachen, en we kunnen het in één zin afmaken: ontdek de volgorde en positie van de primersonde en de wijzigingsmethode.Voor de primerzuiveringsmethode is primersynthese momenteel zo goedkoop, qPCR is PAGE en bovenstaande zuiveringsmethoden waardig en de informatie van het synthese-instrument is niet belangrijk.Veel mensen doen al tientallen jaren primers en weten niet dat de synthesizer ABI3900 is.
Wat betreft de principes van het ontwerpen van primers, je hoeft ze niet uit het hoofd te leren, omdat de meeste software voor het ontwerpen van primers of online tools deze problemen kunnen oplossen (aanbevolen online tool primer3.ut.ee/), en 99,999% van het ontwerpen van primers wordt niet handmatig gedaan Kijk, de auteur ontwerpt soms honderden primers per dag, als je ze één voor één leest, wordt het scheel.
Controleer gewoon de volgende punten nadat de primers zijn ontworpen:
1. Ontwerp primers dicht bij het 3'-uiteinde: in het geval van het gebruik van oligo-dT-primers voor cDNA-synthese van de eerste streng, rekening houdend met de reverse transcriptie-efficiëntie en RNA-integriteit, moeten de ontworpen primers dicht bij het 3'-uiteinde worden ontworpen om de amplificatie-efficiëntie te verbeteren.Gebruik een afbeelding om het als volgt uit te leggen (er is geen manier om dit te begrijpen):

Waarom moeten primers dicht bij het 3'-uiteinde worden ontworpen, het mag niet waar zijn
2. TM-waarde: de Tm-waarde ligt bij 55-65°C (omdat de exonuclease-activiteit het hoogst is bij 60°C) en het GC-gehalte ligt bij 40%-60%.
3. BLAST: Om niet-specifieke amplificatie van het genoom te voorkomen, moet Blast worden gebruikt voor aanvullende verificatie.

MIQE(7)—qPCR-proces

1. qPCR-kit
Volgens de vereisten van MIQE moeten we in het artikel duidelijk de volledige reactieomstandigheden beschrijven, inclusief de configuratie van het PCR-reactiesysteem, welke kit wordt gebruikt, wie de fabrikant is, hoe groot het reactiesysteem is, of de kleurstofmethode of de sondemethode wordt gebruikt, PCR-programma-instellingen.Ervaren coureurs zullen zeker merken dat zolang de kit is geselecteerd, de bovenstaande informatie in wezen wordt bepaald.
Momenteel is de fabricage en productie van fluorescerende kwantitatieve PCR-kits een zeer volwassen technologie.Zolang je geen extreem slechte fabrikanten kiest, is de kans op problemen niet groot, maar we willen toch een paar punten met je delen:
Hot-start Taq-enzym:Het belangrijkste onderdeel van PCR is het hot-start Taq-enzym.De hot-start-enzymen op de markt zijn over het algemeen verdeeld in twee soorten, het ene is een chemisch gemodificeerd hot-start-enzym (je kunt het je voorstellen als paraffine-inbedding), en het andere is een hot-start-enzym voor modificatie van antilichamen (antigeen-antilichaambinding).Chemische modificatie is een vroege manier om enzymen warm te starten.Wanneer een bepaalde temperatuur is bereikt, zal het enzym zijn activiteit vrijgeven.Het antilichaam-gemodificeerde hot-start-enzym gebruikt biologische methoden om de activiteit van het enzym te blokkeren.Wanneer een bepaalde temperatuur is bereikt, wordt het antilichaam gedenatureerd en als eiwit geïnactiveerd en wordt de enzymactiviteit ingeschakeld.

Wat is hier echter het nut van?Dit is het geval, de afgifteactiviteit van antilichaam-gemodificeerde enzymen is sneller dan die van chemisch gemodificeerde enzymen, dus qua gevoeligheid hebben antilichaam-gemodificeerde enzymen een klein voordeel, zodat er in principe geen chemisch gemodificeerde enzymen in de kits op de markt.Als dat zo is, zit de technologie van deze fabrikant nog steeds vast in het tijdperk van het millennium.
Magnesiumionenconcentratie:Magnesiumionenconcentratie is erg belangrijk in de PCR-reactie.Een juiste concentratie magnesiumionen kan de afgifte van Taq-enzymactiviteit bevorderen.Als de concentratie te laag is, zal de enzymactiviteit aanzienlijk worden verminderd;als de concentratie te hoog is, zal de enzym-gekatalyseerde niet-specifieke amplificatie worden versterkt.De concentratie van magnesiumionen heeft ook invloed op het uitgloeien van primers, de smelttemperatuur van de matrijs en PCR-producten, waardoor de opbrengst van geamplificeerde fragmenten wordt beïnvloed.De concentratie van magnesiumionen wordt over het algemeen geregeld op 25 mM.Voor een goede kit moet de concentratie magnesiumionen natuurlijk goed onder controle zijn.Sommige handelaren voegen een magnesiumion-chelaatvormer toe aan het reagens, waardoor het effect van automatische aanpassing van de magnesiumionconcentratie kan worden bereikt.
Fluorescerende kleurstofconcentratie:Fluorescerende kleurstof, de SYBR Green die we meestal gebruiken, genereert voornamelijk fluorescentie door te binden aan de kleine groef van dubbelstrengs DNA, omdat de binding van de kleurstof aan dubbelstrengs DNA niet-specifiek is, dat wil zeggen zolang dubbelstrengs DNA ermee wordt gecombineerd, kan fluorescentie optreden, dus primer-dimeren en DNA-templates in het systeem zullen ermee combineren om een ​​achtergrondsignaal te vormen.
PS: Vanwege de lichtgevoelige eigenschappen worden producten op de markt over het algemeen verpakt in bruine ondoorzichtige centrifugebuisjes (zoals weergegeven in de onderstaande afbeelding).Dit zal echter op een probleem stuiten.Bij het bemonsteren is het moeilijk te zien of de vloeistof wordt aangezogen.Wat dat betreft is Qingke inderdaad het meest gebruiksvriendelijk (zoals op onderstaande afbeelding te zien is) en is de doorzichtige tube verpakt in een ondoorzichtig blikken zakje.Doe het vervolgens in een blikken zak, rekening houdend met het gemak van het vermijden van licht en bemonstering.U moet het juiste productnummer kiezen.TSE204 is een super kosteneffectief bestaan, waardoor ik gras wil planten.

De concentratie van de fluorescerende kleurstof is ook erg belangrijk.Als de concentratie te laag is, zal de amplificatiecurve in een later stadium niet omhoog gaan en niet perfect zijn;als de concentratie te hoog is, veroorzaakt dit ruisinterferentie.Aangezien de fluorescerende kwantitatieve PCR voornamelijk afhangt van de CT-waarde, is het laagste punt beter dan het hoogste punt als de concentratie van de fluorescerende kleurstof niet goed is aangepast.Natuurlijk is de juiste kleurstofconcentratie het beste.

ROX: ROX-kleurstoffen worden gebruikt om fouten in het fluorescentiesignaal van bron tot put te corrigeren.Sommige instrumentfabrikanten vereisen kalibratie, andere niet.Het gebruik van het real-time PCR-amplificatie-instrument van Thermo Fisher Scientific vereist bijvoorbeeld gewoonlijk kalibratie, inclusief 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, enz. De algemene kitinstructies zullen dit beschrijven.
Foregene's qPCR Mix bevat ook ROX-kleurstof, wat handig is voor gebruik in verschillende modellen.

Realtime PCR-kit-Taqman

Behandeling met zwakke waterstofbruggen: De behandeling van zwakke waterstofbruggen is een relatief technische aangelegenheid.Niets heeft de handleidingen van veel kits gelezen, maar geen van hen heeft dit onderwerp genoemd.Sterker nog, het is zo belangrijk.De combinatie van basen hangt voornamelijk af van de sterkte van waterstofbruggen.Sterke waterstofbruggen zijn normale amplificatie en zwakke waterstofbruggen leiden tot niet-specifieke amplificatie.Als zwakke waterstofbruggen niet goed kunnen worden geëlimineerd, kan niet-specifieke amplificatie niet worden vermeden.Binnen de reikwijdte van de auteur hebben slechts enkele bedrijven dit probleem opgemerkt.Bij aankoop van de kit kunt u aangeven of u op dit punt een oplossing heeft overwogen voor de kit die u wilt kiezen.

Reactievolume: Het 20-50ul-systeem wordt vaker gebruikt en kleinere volumes veroorzaken waarschijnlijk fouten.Over het algemeen bevelen de kitinstructies het gebruik van PCR-reactievolumes aan.Wees niet slim en gebruik kleinere volumes om kosten te besparen.het doel van.Het door de verkopers aanbevolen volume is daadwerkelijk getest en het kan zijn dat ze het probleem van fouten veroorzaakt door kleine volumes niet kunnen oplossen.
2. De fabrikant en het artikelnummer van de buisplaat
Iedereen kent het principe van fluorescerende kwantitatieve PCR.Fluorescentieverzameling wordt voornamelijk uitgevoerd door middel van PCR-buisdoppen.Let bij het kiezen van PCR-verbruiksartikelen op twee punten: goede lichttransmissie en geschikt voor het instrument.Over het algemeen zijn de boards en tubes van reguliere merken prima, maar je moet wel goed kiezen qua aanpassing, anders kun je het instrument niet gebruiken.

4. Kennis op topniveau

MIQE (8) - qPCR-validatie
Dit is de topprioriteit van qPCR!Zoveel helden zijn hier in het zand gevallen.Het kan natuurlijk ook dat je geluk hebt en de genen die je hebt bestudeerd simpel zijn, waardoor je door de ijsgrot langs de wind zweefde.De verificatie-informatie van qPCR is bedoeld om de betrouwbaarheid van de gegevens te testen.We vermelden de benodigde verificatie-informatie als volgt:

1. Specificiteitstest
De specificiteit van doelgenamplificatie wordt getest door te controleren of het elektroforesebeeld een enkele band is;sequentieverificatie;smeltkromme om te zien of de piekkaart enkelvoudig is;verificatie van de enzymvertering en andere methoden.
Hier concentreren we ons op tDe analyse van niet-specifieke amplificatie met behulp van de methode van smeltkrommen.Over het algemeen geldt dat wanneer we primers ontwerpen, de grootte van het productfragment tussen 80 en 200 bp moet liggen, waardoor de smelttemperatuur van het PCR-product tussen 80 en 85 °C ligt.Daarom, als er verschillende pieken zijn, moeten er andere niet-specifieke versterkingsproducten zijn;als de piek onder 80°C verschijnt, wordt deze in het algemeen beschouwd als een primerdimeer;als de piek boven 85°C verschijnt, wordt dit over het algemeen beschouwd als DNA-verontreiniging of meer niet-specifieke amplificatie van grote fragmenten.
Let op: Soms is er maar één piek bij 80°C.Op dit moment moet dit concept worden nageleefd.Het is waarschijnlijk dat de amplificatieresultaten allemaal primerdimeren zijn.

Normale smeltkromme (enkele piek zonder niet-specifieke versterking)

Problematische smeltkromme (niet-specifieke versterking van valse pieken)
【Zaak analyse】

Er is een hoofdpiek, maar de primerdimeer is serieus
De smeltkromme met één piek in de onderstaande afbeelding kan uw ogen gemakkelijk bedriegen door te denken dat het een perfect experiment is, maar het resultaat is volkomen verkeerd.Op dit moment moeten we kijken naar de smelttemperatuur.De piektemperatuur ligt onder de 80°C, wat volledig primer-dimeer is.

Geen doelfragment, allemaal primerdimeren
Hier, mijn broer kan niet stoppen.Onderstaande foto is een foto gemaakt met een mobiele telefoon die mij door een klootzak is toegestuurd.De reagentia die hij gebruikte, zijn allemaal veelgebruikte merken in de industrie.Hij veranderde van het ene T-prefix-merk in het andere T-prefix-merk.Ik denk dat je het al geraden hebt.De klootzak riep me toe: “Het reagens dat op de eerste foto is gebruikt, is te goed en de piek is enkelvoudig.Later, na gebruik van het door u aanbevolen reagens, wordt het zoals op de tweede foto, met gemengde pieken.Je hebt me ongelukkig gemaakt.“
Scheid de twee grafieken.Op het eerste gezicht heeft de ene een enkele piek en de andere een dubbele piek.Onzin, een enkele piek is natuurlijk prima.Is dat waar?
Erger nog dan Dou E, als ik de twee plaatjes in onderstaande plaatje zet, snap je het meteen.In feite zijn we gemakkelijk verlamd door dit soort foto's.Na zorgvuldige analyse vonden we dat: de piek van het eerste cijfer bij 75°C ligt, wat volledig primerdimeer is;de piek van het tweede cijfer verschijnt bij 75°C en 82°C, in ieder geval zijn er Het product verschijnt.

Foto's van feedback van studenten
Het fundamentele probleem is dus niet het probleem van de reagentia, maar het probleem van het ontwerp van de primer.Tegelijkertijd bewijst het ook dat sommige grote merken niet van ijzerkwaliteit zijn, en het bewijst ook wat mijn broer eerder zei: het is niet het reagensmerk dat uw artikel ondersteunt.Het is uw artikel dat het merk reagentia heeft ondersteund.Stel je voor dat als de klootzak de reagentia niet zou veranderen, de verkeerde gegevens naar het tijdschrift zouden worden gestuurd, en wat er zou gebeuren zou een tragedie zijn.
2. Ct-waarde van blanco controle
Niet uitleggen, als de blanco controle een Ct-waarde heeft, is het dan geen vervuiling?U moet echter nog steeds begrijpen welke lege controle een Ct-waarde heeft.Als het NTC is, betekent dit dat er vreemd DNA is, zoals reagensverontreiniging.Als het NRT is, betekent dit dat het geëxtraheerde RNA DNA-verontreiniging heeft.
3. Standaardkromme
Inclusief de helling en rekenformule kan via de formule de PCR-efficiëntie worden berekend.Een perfect experiment vereist dat de helling van de standaardcurve 3,32 benadert en dat R² 0,9999 benadert.
4. Lineair dynamisch bereik
Het dynamische bereik van de reactie is lineair.Volgens de sjabloon die wordt gebruikt om de standaardcurve te genereren, moet het dynamische bereik ten minste 5 concentratiegradiënten omvatten en aandacht besteden aan de verandering van Ct-waarden bij hoge concentratiegradiënten en lage concentratiegradiënten.
5. Detectienauwkeurigheid
Veranderingen in qPCR-resultaten, dat wil zeggen slechte herhaalbaarheid, dat wil zeggen slechte precisie, worden veroorzaakt door vele factoren, waaronder temperatuur, concentratie en werking.qPCR-precisie wordt over het algemeen minder beheersbaar naarmate het aantal kopieën afneemt.Idealiter zou deze technische variatie binnen-experimenteel zijn, en zou deze technische variatie onderscheiden moeten zijn van biologische variatie, en biologische replicaten kunnen direct statistische verschillen in qPCR-resultaten tussen groepen of behandelingen aanpakken.Met name voor diagnostische assays moet de beste inter-assayprecisie (herhaalbaarheid) voor alle locaties en operators worden gerapporteerd.
6. Detectie-efficiëntie en LOD (in multiplex qPCR)
LOD is de laagste concentratie van 95% van de gedetecteerde positieve monsters.Met andere woorden, de LOD-concentratie in een set doelgenreplicaten mag niet hoger zijn dan 5% van de mislukte reacties.Bij het uitvoeren van multiplex qPCR-analyse, met name voor gelijktijdige detectie van puntmutaties of polymorfismen, moet multiplex qPCR bewijs leveren dat de nauwkeurigheid van meerdere doelfragmenten niet in het gedrang komt in hetzelfde buisje, meervoudige detectie en detectie van een enkel buisje. Efficiëntie en LOD moeten hetzelfde zijn.Vooral wanneer hooggeconcentreerde doelgenen en laaggeconcentreerde doelgenen gelijktijdig worden geamplificeerd, moet aan dit probleem aandacht worden besteed.
Problemen en oplossingenOver het algemeen richten de problemen die zich vaak voordoen bij qPCR-foutopsporing zich op de volgende aspecten:
· niet-specifieke versterking
·Moeilijke keuze van primerconcentratie en problemen met primer-dimeren
·De gloeitemperatuur is onnauwkeurig
·Secundaire structuur beïnvloedt de efficiëntie van de versterking
niet-specifieke versterking
niet-specifieke versterkingvoorkomt, wordt over het algemeen overwogen of het ontwerp van de primer niet geschikt is, maar als u geen haast heeft om de primers te vervangen, kunt u eerst de volgende methoden proberen (het principe is ook bijgevoegd):
·Verhoog de gloeitemperatuur - probeer zwakke waterstofbruggen niet in stand te houden;
· Verkort de gloei- en rektijd – verklein de kans op zwakke waterstofbruggen;
· Verminder primerconcentratie – verminder de kans op binding van overbodige primers en niet-doelgebieden;
Lage versterkingsefficiëntie
De tegenovergestelde situatie van niet-specifieke versterking - lage versterkingsefficiëntie en de maatregelen om met lage versterkingsefficiëntie om te gaan, zijn precies het tegenovergestelde:
· Verleng de onthardings- en rektijd;
· Schakel over op PCR in drie stappen en verlaag de gloeitemperatuur;
·Verhoog de primerconcentratie;
Ps: Veel afgestudeerde studenten geboren in de jaren 90 zijn niet bereid om te bestuderen hoe ze experimenten kunnen debuggen, en hopen dat de kit het probleem volledig kan oplossen (als je na je afstuderen naar een reagensbedrijf wilt gaan om onderzoek en ontwikkeling te doen), in feite denken de reagensfabrikanten ook zo, ik hoop dat het een dwaas is.Om het probleem gemakkelijk op te lossen, moeten dwazen nog steeds de introductie van het reagensbedrijf lezen om te zien of er een factor is die zwakke waterstofbruggen absorbeert.
Moeilijke keuze van primerconcentratie en problemen met primer-dimeren
Methode 1: Over het algemeen hebben de kitinstructies voor qPCR aanbevolen systemen en aanbevolen primerconcentraties.
Methode 2: Foutopsporing door de primerconcentratiegradiënt in te stellen.Onderstaande foto is gestolen van een bedrijf ter illustratie.De onderstaande afbeelding toont de kwantitatieve fluorescentieresultaten gemaakt met drie primerconcentratiegradiënten (100 nM, 250 nM, 500 nM) en vier matrijsconcentratiegradiënten (0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng).De Ct-waarde van de experimentele resultaten wordt als volgt uitgezet:

Selectie primerconcentratie Voeg elke primerconcentratie als volgt samen in een lijn:

De keuze van de primerconcentratie ligt voor de hand, de lineaire relatie van de primerconcentratie van 100 nM en 250 nM is beter en de lineaire relatie van de primerconcentratie van 500 nM is relatief slecht.In 100 nM en 250 nM is de Ct-waarde van 250 nM relatief klein, dus de optimale primerconcentratie is 250 nM.Over het algemeen zijn ernstige primer-dimeren te zien in de smeltkromme.Wat als de ontworpen primers primer-dimeren niet kunnen vermijden?
Methode 3: Verminder de hoeveelheid primers en verhoog de gloeitemperatuur (geen uitleg nodig).
De empirische waarde van de gloeitemperatuur is 60°C.Als u het niet zeker weet, hoe kiest u dan een meer geschikte gloeitemperatuur?Het antwoord is hetzelfde als de keuze van de primerconcentratie -gradiënt test.Maak een foto van het bedrijf Bio-rad om het probleem te illustreren.Stel voor de amplificatie van een bepaald doelfragment acht temperatuurgradiënten in, elk met drie herhalingen, en de verkregen amplificatiecurve is als volgt:

gloeien temperatuur selectie:
·70°C, 69°C—In principe kunnen de primers niet worden gecombineerd, dus er is geen amplificatie.
·67.3°C – Er is een kleine versterking in het begin en de Ct-waarde is relatief groot.
·64.5°C——De Ct-waarde neemt af.
·Bij 60,7 °C, 58,0 °C, 56,2 °C en 55,0 °C waren de Ct-waarden in wezen stabiel, maar de uiteindelijke fluorescentiewaarden waren verschillend.
Hoe te kiezen?Principe: Het eerste principe is de hogere Ct-waarde.Kies voor dezelfde Ct-waarde een hogere gloeitemperatuur om dimerisatie en niet-specifieke amplificatie te voorkomen.Hoewel er een hogere fluorescentiewaarde is bij 55°C, kunnen er dimeren of niet-specifieke amplificatie in zitten.
Maar als je zo slim bent als jij, zul je zeker denken: Logisch gezien, als de PCR-reactie heel specifiek is, zolang de primerconcentratie de minimale vereiste overschrijdt, zouden de hoge en lage punten geen effect moeten hebben, net als fluorescerende kleurstoffen en dNTP's.Inderdaad, zolang de gloeitemperatuur goed wordt geoptimaliseerd, zal het effect van de primerconcentratie op de Ct-waarde natuurlijk worden geminimaliseerd.

De gloeitemperatuur wordt goed geoptimaliseerd en het effect van primerconcentratie op CT wordt geminimaliseerd
Secundaire structuur beïnvloedt de efficiëntie van de versterking
Laten we de foto van Bio-rad nemen om het probleem te illustreren.Het ontwerpt ook een temperatuurgradiënt om een ​​gen met een secundaire structuur te versterken.

Secundaire structuur ontstaat
Het is te zien dat naarmate de temperatuurgradiënt afneemt, producten beginnen te verschijnen en de Ct-waarde naar voren beweegt, waarbij de minimumwaarde bij 60,7°C wordt bereikt, en naarmate de temperatuurgradiënt afneemt, wordt de Ct-waarde groter.Omgekeerd, als de temperatuur stijgt, gaat de secundaire structuur open en neemt de versterkingsefficiëntie toe.Na het bereiken van een bepaalde temperatuur kan het verhogen van de temperatuur de versterkingsefficiëntie niet verbeteren.Omdat de primers op dit moment niet stabiel kunnen worden gecombineerd.Daarom,zoek de temperatuur met de laagste Ct-waarde, wat de beste temperatuur is voor het versterken van de sjabloon van de secundaire structuur!Slimme dwazen moeten natuurlijk weten dat als het niet nodig is, het het beste is om de primers te vervangen en het secundaire structuurgebied te vermijden.
5. Toepassingsniveau
MIQE - Gegevensanalyse

De gegevensanalyse wordt voornamelijk gegeven door het fluorescerende kwantitatieve PCR-instrument.In het vorige artikel is veel data-analysewerk gedaan, zoals de blanco controle, die is uitgelegd in het ontwerp van het experiment.De interne referentiegenen, herhalingsnummers, etc. zijn opgehelderd., leggen we hier vooral de toepassing van qPCR uit.
qPCR wordt veel gebruikt en experimentele verificatie en nucleïnezuurdiagnose zijn de meest gebruikte scenario's.
absolute kwantificering
Log (beginconcentratie) heeft een lineaire relatie met het aantal cycli.Een standaardcurve kan worden getrokken uit een standaard met een bekend initieel aantal kopieën, dat wil zeggen dat de lineaire relatie van de amplificatiereactie kan worden verkregen.Volgens de Ct-waarde van het monster kan de concentratie in het monster worden berekend.Het aantal op te nemen sjablonen.

Absolute kwantitatieve berekeningsmethode
Absolute kwantificering moet gebaseerd zijn op de standaardcurve.Om een ​​standaardcurve te maken, is een standaard vereist.Gewoonlijk is de standaard een plasmide dat wordt verkregen door het doelgen te klonen.Waarom is het een plasmide?Omdat circulair plasmide-DNA het meest stabiel is.Verdun het standaardproduct in 5 tot 6 gradiënten volgens de verdubbelingsratio (10-voudige verdunning) en let op de uniformiteit bij het verdunnen.Laat de Ct-waarde vallen tussen 15-30.

Standaard bereiding
Tegelijkertijd moet het te testen monster dienovereenkomstig worden verdund (denk aan de verdunningsfactor), en de Ct-waarde moet ook tussen 15-30 liggen.Het standaardproduct + het te testen monster worden samen op de machine gezet.Na de run werd een standaardkromme gemaakt met de standaardstof en werden de te testen monsters in de standaardkromme gebracht om de concentratie te berekenen.
Hepatitis B-virus HBV-kwantificatie is een typische absolute kwantificering, die het aantal viruskopieën in 1 ml bloed kan berekenen.
Berekening van het aantal exemplaren
Te testen monsterconcentratie (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × verdunningsfactor
Monster molecuulgewicht = aantal basen × 324
Het aantal kopieën van het te testen monster (kopieën/ul) = de concentratie van het te testen monster / het molecuulgewicht van het monster × 6 × 1014

Berekeningswijze exemplaarnummer

Bovenstaande is de berekeningsmethode voor het bepalen van de hoeveelheid.Dit is een wiskundig probleem dat kan worden opgelost nadat je bent afgestudeerd aan de middelbare school, en wiskundige problemen worden over het algemeen opgelost door computers.Als je het niet begrijpt, kun je komen communiceren.
relatieve kwantificering
Relatieve kwantificering wordt voornamelijk gebruikt in wetenschappelijk onderzoek.Hoeveel virussen zitten er in 1 ml bloed, en het is een DNA-virus, dit is een relatief deterministische gebeurtenis: de hoeveelheid bloed kan worden bepaald en het DNA-virus is relatief stabiel.Het is echter moeilijk voor ons om het aantal transcriptiekopieën van een bepaald gen in een blad te vergelijken, omdat het moeilijk is om de grootte, het gewicht en de zachtheid van het blad te bepalen, de hoeveelheid geëxtraheerd RNA moeilijk te bepalen is, en de efficiëntie van omgekeerde transcriptie is ook moeilijk te bepalen, dat wil zeggen dat elke stap ervoor kan zorgen dat de experimentele gegevens bugs bevatten en niet kunnen worden gebruikt.
Daarom moet relatieve kwantificering een element introduceren:het interne referentiegen.
Met andere woorden, relatieve kwantificering is eigenlijk een vergelijking tussen het doelgen en het interne referentiegen.Vergeleken in hetzelfde weefsel en dezelfde cel is de invloed van de steekproefomvang, de hoeveelheid RNA-extractie, de efficiëntie van de omgekeerde transcriptie en de efficiëntie van PCR relatief klein.Vanwege de kleine steekproefomvang waren zowel interne referentiegenen als doelwitgenen relatief klein.Daarom hebben we al eerder de nadruk gelegd op uniformiteit en stabiliteit.
Interne referentiegenen zijn over het algemeenhuishoudelijke genen(huishoudgenen), die verwijzen naar een klasse van genen die stabiel tot expressie komen in alle cellen, en hun producten zijn nodig om de basislevensactiviteiten van cellen te behouden.
Verwar dit concept niet.Huishoudgenen zijn biologische functietermen, terwijl interne referentiegenen experimentele technische termen zijn.Huishoudgenen moeten worden gevalideerd voordat ze kunnen worden geselecteerd als interne referentiegenen.
We selecteerden bijvoorbeeld verschillende huishoudgenen in de onderstaande afbeelding om hun expressieniveaus in verschillende weefselcellen te testen, en ontdekten dat de expressieniveaus van β-2-microglobuline behoorlijk verschilden van die van de andere drie genen, dus ze konden niet worden gebruikt als interne referentiegenen.

Na het begrijpen van de correctiefunctie van het interne referentiegen, worden twee algoritmen afgeleid vanwege de introductie van het interne referentiegen.
·dubbele standaard curve methode
·2 – △△Ct-methode (CT-waardevergelijkingsmethode)
Als je geïnteresseerd bent in het bestuderen van soorten en genfuncties, geef dan alsjeblieft het onderzoek naar algoritmen op en gebruik direct formules, of gebruik direct machines;als je een heteroman bent in wiskunde en techniek, voel je dan vrij.
dubbele standaard curve methode
Kwantificeer het doelgen en huishoudgen van het controlemonster en het te testen monster via de standaardcurve en bereken vervolgens de relatieve waarde volgens de berekeningsformule, die het relatieve expressieniveau is.
Voordelen: eenvoudige analyse, relatief eenvoudige experimentele optimalisatie
Nadeel: voor elk gen moet elke experimentronde een standaardcurve maken
Toepassing: een van de twee meest gebruikte en erkende relatieve kwantitatieve methoden in de studie van genexpressieregulatie
De formule is als volgt:

Voorbeelden zijn als volgt:

Bereken het relatieve bedrag op basis van het kwantitatieve resultaat
2 – △△Ct-methode (CT-waardevergelijkingsmethode)

Voordelen: U hoeft geen standaardbocht te maken
Nadelen: Aangenomen wordt dat de versterkingsefficiëntie bijna 100% is;de standaarddeviatie is < 5%, en de standaardcurve en de efficiëntie tussen elke versterking worden verondersteld consistent te zijn;de optimalisatie van experimentele omstandigheden is ingewikkelder.
Toepassing: een van de twee meest gebruikte en erkende relatieve kwantitatieve methoden in de studie van genexpressieregulatie

Natuurlijk is de amplificatie-efficiëntie meestal onmogelijk om perfect 1 te zijn. Correctiemethode: Als we weten dat het doelgen en het referentiegen dezelfde amplificatie-efficiëntie hebben, maar de amplificatie-efficiëntie is niet gelijk aan 1, dan kan 2－△△Ct worden gecorrigeerd als: (1+E )－△△Ct, bijvoorbeeld als de amplificatie-efficiëntie 0,95 is, dan kan de berekeningsformule worden gecorrigeerd tot 1,95 -△△Ct
Tot nu toe is de inhoud over fluorescente kwantitatieve PCR ten einde.