Probleemanalyse gids

De volgende analyse van de problemen die u kunt tegenkomenPlant TotaalRNA extraction will help you with your experiments. In addition, for other experimental or technical problems in addition to operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us at: 028-83360257 or E-mali : Tech@foregene.com.

De spinkolom is verstopt

Blokkering van de spinkolom zal ervoor zorgen dat de RNA-opbrengst wordt verminderd of zelfs niet kan worden gezuiverd om RNA te verkrijgen, en de kwaliteit van het verkregen RNA zal laag zijn.

Analyse van gemeenschappelijke oorzaken:

1. Het monster is niet volledig gebroken.

Onvolledige monsterfragmentatie kan de DNA-reinigingskolom blokkeren, wat ook de opbrengst en kwaliteit van RNA kan beïnvloeden.We raden aan om bij het uitvoeren van monsterfragmentatie snel voldoende hoeveelheden vloeibare stikstof te vermalen om de weefsels zoals celwanden en celmembranen van de monsters zoveel mogelijk te verbreken.Voor plantenmonsters van polyfenolpolysacchariden raden we u aan Plant Total RNA Isolation Kit Plus te gebruiken.

2.Aspireer het geïsoleerde supernatant van de DNA-reinigingskolom en zuig de eventuele celrestenpellet op.

Opgezogen celrestenpellet kan de kolom met alleen RNA verstoppen tijdens RNA-adsorptieprocedures (zie stap 5 van de procedure, stap 6 van de polysaccharidepolyfenolprocedure).We raden aan om voorzichtig te zijn bij het opzuigen van dit supernatant om te voorkomen dat celresten worden afgezogen.

3. De aanvankelijke hoeveelheid monster is te groot.

Overmatig monstergebruik zal resulteren in onvolledige monsterfragmentatie of onvolledige lysis van cellen door Buffer PRL1 of Buffer PSL1, wat resulteert in een verstopte zuiveringskolom voor zuiveringsoperaties.Plant Total RNA Isolation Kit heeft een aanvankelijk maximum van 50 mg per enkele zuivering van een geopereerd monster.Voor plantenmonsters van polyfenolpolysacchariden raden we u aan de Plant Total RNA Isolation Kit Plus te proberen.

4. De temperatuur van de centrifuge is te laag.

Hele RNA-isolatie en -zuivering behalve vloeibare stikstofverstoring van monsterweefsel, alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-25 °C).Sommige lage-temperatuurcentrifuges hebben temperaturen onder de 20 °C, wat verstoppingen in de DNA-reinigingskolom en/of de RNA-kolom kan veroorzaken.Als dit gebeurt, stelt u de centrifugetemperatuur in op 20-25 °C en verwarmt u het lysismengsel en/of de toevoeging van ethanolscheidingssupernatant voor tot 37 °C.

Er is geen RNA geëxtraheerd of de RNA-opbrengst is laag

Er zijn meestal veel factoren die de herstelefficiëntie beïnvloeden, zoals: monster-RNA-inhoud, werkwijze, het elutievolume, enz.

Analyse van veelvoorkomende oorzaken zoals hieronder:

1. Tijdens de operatie werd een ijsbad of centrifugatie bij lage temperatuur (4°C) uitgevoerd.

Suggestie: Werk bij kamertemperatuur (15-25°C) gedurende het hele proces, doe geen ijsbad en centrifugatie bij lage temperatuur.

       2.Het RNA is afgebroken als gevolg van onjuiste bewaring van het monster of langdurige bewaring van het monster.

Aanbeveling: Vers verzamelde monsters moeten snel worden ingevroren in vloeibare stikstof en vervolgens lange tijd bij -80 °C worden bewaard, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien van monsters;of laat de monsters onmiddellijk weken in RNA-stabilisator RNAlater-oplossing (dierlijke monsters).

       3.Onvoldoende monsterfragmentatie en lysis leiden tot verstopping van de zuiveringskolom.

Suggestie: Zorg er bij het vermalen van het weefsel voor dat het voldoende gemalen is en breng het snel over naar de vooraf bereide Buffer PSL1 (bevestig dat de juiste hoeveelheid β-ME is toegevoegd, zie stap 1 van de procedure).

4. Het eluens is verkeerd toegevoegd.

Suggestie: zorg ervoor dat RNase-Free ddH₂O wordt in het midden van het membraan van de zuiveringskolom gedruppeld.

5. Het juiste volume absolute ethanol is niet toegevoegd aan buffer PSL2 of buffer PRW2.

Suggestie: Volg de instructies, voeg het juiste volume absolute ethanol toe aan Buffer PSL2 en Buffer PRW2 en meng goed voordat de kit wordt gebruikt.

6.De hoeveelheid weefselmonster is ongepast.

Suggestie: Gebruik 50 mg weefsel per 500 μl Buffer PSL1.Het gebruik van te veel weefsel zal de hoeveelheid geëxtraheerd RNA verminderen en de zuiverheid van het resulterende RNA zal ook afnemen.We raden ten zeerste aan dat de initiële monsterdosering niet hoger is dan 50 mg per RNA-extractiebewerking.

7. Onjuist elutievolume of onvolledige elutie.

Suggestie: Het eluensvolume van de zuiveringskolom is 50-200 μl;als het elutie-effect niet bevredigend is, wordt aanbevolen om de tijd bij kamertemperatuur te verlengen na toevoeging van voorverwarmd RNase-Free ddH₂O, zoals 5-10min.

8. De zuiveringskolom bevat ethanolresidu na wassen met Buffer PRW2.

   Suggestie: Als de lege buis gedurende 1 minuut wordt gecentrifugeerd en er is nog steeds ethanol over na het wassen in Buffer PRW2, kunt u de tijd van de lege buiscentrifugeren verhogen tot 2 minuten, of de zuiveringskolom gedurende 5 minuten op kamertemperatuur plaatsen om de resterende ethanol volledig te verwijderen.

9. De kit is verkeerd gebruikt.

   Suggestie: Voor plantenmonsters van polyfenolische polysacchariden kan het gebruik van gewone kits zoals Plant Total RNA Isolation Kit mogelijk geen ideale RNA-monsters verkrijgen.We raden u aan Plant Total RNA IsolationKit Plus te gebruiken, dat speciaal is ontworpen voor polyfenolische polysaccharide plantenmonsters.Een kit speciaal ontwikkeld voor het extraheren van RNA uit plantenmonsters van polyfenolen en polysacchariden.

OD260/OD280-waarde is laag

RNA-elutie met ddH₂O en gebruikt voor spectrofotometermetingen resulteert in lage OD260/OD280-waarden.We raden aan om 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 te gebruiken (in plaats van RNase-Free ddH₂O om RNA te elueren) om relatief correcte OD260/OD280-waarden te verkrijgen, zie “RNA Concentration and Purification Assays” op pagina 19.

Het gezuiverde RNA wordt afgebroken

De kwaliteit van gezuiverd RNA is gerelateerd aan factoren zoals het bewaren van monsters, RNase-besmetting en manipulatie.

Analyse van veelvoorkomende oorzaken:

1. Weefselmonsters werden na verzameling niet op tijd bewaard.

    Aanbeveling: Als de weefselmonsters na afname niet tijdig worden gebruikt, bewaar ze dan onmiddellijk in vloeibare stikstof bij lage temperatuur of breng ze voor langdurige opslag na snel invriezen in vloeibare stikstof over naar -80°C, of ​​dompel de monsters onmiddellijk onder in RNA-stabilisator RNAlater-oplossing (dierlijke monsters).Probeer voor RNA-extractie vers verzamelde weefselmonsters te gebruiken.

2. Herhaaldelijk invriezen en ontdooien van weefselmonsters.

   Suggestie: Bij het bewaren van weefselmonsters kunt u ze het beste in kleine stukjes snijden om ze te bewaren, en een deel ervan verwijderen wanneer u ze gebruikt om de afbraak van RNA als gevolg van herhaaldelijk invriezen en ontdooien van de monsters te voorkomen.

3.RNase wordt geïntroduceerd in de operatiekamer of niet gedragen wegwerphandschoenen, maskers, enz.

   Suggestie: RNA-extractie-experimenten kunnen het beste worden uitgevoerd in afzonderlijke RNA-operaties, en de laboratoriumtafel moet vóór het experiment worden schoongemaakt en tijdens het experiment moeten wegwerphandschoenen en -maskers worden gedragen om RNA-degradatie veroorzaakt door de introductie van RNase zoveel mogelijk te voorkomen.

4. Het reagens wordt tijdens gebruik verontreinigd door RNase.

   Suggestie: Vervang door een nieuwe serie totaal-RNA-extractiekits voor planten voor gerelateerde experimenten.

5. De centrifugebuisjes en pipetpunten die worden gebruikt voor RNA-manipulatie zijn verontreinigd met RNase.

Suggestie: Zorg ervoor dat de centrifugebuisjes, pipetpunten, pipetten enz. die bij RNA-extractie worden gebruikt allemaal RNase-vrij zijn.

Handleidingen:

Plant Total RNA Isolation Kit Gebruiksaanwijzing