Uitleg van basistermen in de moleculaire biologie
1. cDNA en cccDNA: cDNA is een dubbelstrengs DNA gesynthetiseerd door reverse transcriptase van mRNA;cccDNA is een plasmide dubbelstrengs gesloten circulair DNA vrij van het chromosoom.
2. Standaard vouweenheid: de eiwit secundaire structuureenheid α-helix en β-sheet kunnen structurele blokken vormen met speciale geometrische arrangementen door middel van verschillende verbindende polypeptiden.Dit type vastberaden vouwen wordt meestal super secundaire structuur genoemd.Bijna alle tertiaire structuren kunnen worden beschreven door deze vouwtypen, en zelfs hun gecombineerde typen, daarom worden ze ook standaard vouweenheden genoemd.
3. CAP: cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) receptor eiwit CRP (cAMP receptor eiwit), het complex gevormd na de combinatie van cAMP en CRP heet activerend eiwit CAP (cAMP geactiveerd eiwit)
4. Palindroomsequentie: de omgekeerde complementaire sequentie van een segment van een DNA-fragment, vaak een restrictie-enzymplaats.
5. micRNA: Complementair interfererend RNA of antisense RNA, dat complementair is aan de mRNA-sequentie en de translatie van mRNA kan remmen.
6. Ribozym: RNA met katalytische activiteit, dat een autokatalytische rol speelt in het splitsingsproces van RNA.
7. Motief: er zijn enkele lokale regio's met een vergelijkbare driedimensionale vorm en topologie in de ruimtelijke structuur van eiwitmoleculen
8. Signaalpeptide: een peptide met 15-36 aminozuurresiduen aan het N-uiteinde tijdens eiwitsynthese, dat het transmembraan van het eiwit geleidt.
9. Verzwakker: een nucleotidesequentie tussen een operatorgebied en een structureel gen dat de transcriptie beëindigt.
10. Magic Spot: Wanneer de bacterie groeit en een volledig gebrek aan aminozuren tegenkomt, zal de bacterie een noodreactie produceren om de expressie van alle genen te stoppen.De signalen die deze noodhulp genereren zijn guanosinetetrafosfaat (ppGpp) en guanosinepentafosfaat (pppGpp).De rol van PpGpp en pppGpp is niet slechts één of enkele operons, maar beïnvloedt een groot aantal van hen, dus worden ze superregulatoren of magische plekken genoemd.
11. Stroomopwaarts promotorelement: verwijst naar de DNA-sequentie die een regulerende rol speelt in de activiteit van de promotor, zoals TATA in het -10-gebied, TGACA in het -35-gebied, versterkers en verzwakkers.
12. DNA-probe: een gelabeld DNA-segment met een bekende sequentie, dat veel wordt gebruikt om onbekende sequenties te detecteren en doelgenen te screenen.
13. SD-sequentie: het is de bindende sequentie van ribosoom en mRNA, die de translatie reguleert.
14. Monoklonaal antilichaam: een antilichaam dat alleen werkt tegen een enkele antigene determinant.
15. Cosmid: Het is een kunstmatig geconstrueerde exogene DNA-vector die de COS-gebieden aan beide uiteinden van de faag vasthoudt en is verbonden met het plasmide.
16. Blauw-witte vlekscreening: LacZ-gen (coderend voor β-galactosidase), het enzym kan het chromogene substraat X-gal (5-broom-4-chloor-3-indool-β-D-galactoside) ontleden om blauw te produceren, waardoor de stam blauw wordt.Wanneer het exogene DNA is ingebracht, kan het LacZ-gen niet tot expressie worden gebracht en is de stam wit om de recombinante bacteriën te screenen.Dit wordt blauw-wit afscherming genoemd.
17. Cis-werkend element: een specifieke reeks basen in DNA die genexpressie reguleert.
18. Klenow-enzym: Groot fragment van DNA-polymerase I, behalve dat de 5' 3'-exonuclease-activiteit is verwijderd uit het DNA-polymerase I-holo-enzym
19. Verankerde PCR: wordt gebruikt om het betreffende DNA te amplificeren met een bekende sequentie aan één uiteinde.Aan één uiteinde van de onbekende sequentie werd een poly-dG-staart toegevoegd en vervolgens werden de poly-dC en de bekende sequentie gebruikt als primers voor PCR-amplificatie.
20. Fusie-eiwit: het gen van het eukaryote eiwit is verbonden met het exogene gen en het eiwit dat is samengesteld uit de vertaling van het originele gen-eiwit en het exogene eiwit wordt tegelijkertijd tot expressie gebracht.
Andere termen uit de moleculaire biologie
1. De fysieke kaart van DNA is de volgorde waarin de (restrictie-endonuclease-gedigereerde) fragmenten van het DNA-molecuul zijn gerangschikt.
2. De splitsing van RNase is verdeeld in twee typen (autokatalyse) en (heterokatalyse).
3. Er zijn drie initiatiefactoren in prokaryoten: (IF-1), (IF-2) en (IF-3).
4. Transmembraaneiwitten hebben begeleiding nodig (signaalpeptiden), en de rol van eiwitchaperonnes is (helpt de peptideketen te vouwen tot de natieve conformatie van het eiwit).
5. Elementen in promotors kunnen over het algemeen in twee typen worden verdeeld: (kernpromotorelementen) en (stroomopwaartse promotorelementen).
6. De onderzoeksinhoud van moleculaire biologie omvat hoofdzakelijk drie delen: (structurele moleculaire biologie), (genexpressie en regulatie) en (DNA-recombinatietechnologie).
7. De twee belangrijkste experimenten die aantonen dat DNA het genetische materiaal is, zijn (pneumokokkeninfectie van muizen) en (T2-faaginfectie van Escherichia coli).potentieel).
8. Er zijn twee belangrijke verschillen tussen hnRNA en mRNA: (hnRNA wordt gesplitst tijdens het proces van omzetting in mRNA), (het 5'-uiteinde van het mRNA wordt toegevoegd met een m7pGppp-dop en er is een extra polyadenylatie aan het 3'-uiteinde van de mRNA-zuur (polyA) staart).
9. De voordelen van de multi-subunit-vorm van eiwit zijn (subunit is een economische methode voor DNA-gebruik), (kan de impact van willekeurige fouten in eiwitsynthese op eiwitactiviteit verminderen), (activiteit kan zeer efficiënt en snel worden geopend en gesloten).
10. De belangrijkste inhoud van de eerste nucleatietheorie van het eiwitvouwmechanisme omvat (nucleatie), (structurele verrijking), (uiteindelijke herschikking).
11. Galactose heeft een dubbel effect op bacteriën;aan de ene kant (het kan worden gebruikt als koolstofbron voor celgroei);aan de andere kant (het is ook een onderdeel van de celwand).Daarom is een cAMP-CRP-onafhankelijke promoter S2 nodig voor de permanente synthese op achtergrondniveau;tegelijkertijd is een cAMP-CRP-afhankelijke promotor S1 nodig om de synthese op hoog niveau te reguleren.Transcriptie begint vanaf (S2) met G en vanaf (S1) zonder G.
12. Recombinant-DNA-technologie wordt ook wel (genklonen) of (moleculair klonen) genoemd.Het uiteindelijke doel is (het overdragen van de genetische informatie DNA in het ene organisme in een ander organisme).Een typisch DNA-recombinatie-experiment omvat gewoonlijk de volgende stappen: (1) Extraheer het doelgen (of exogeen gen) van het donororganisme en verbind het enzymatisch met een ander DNA-molecuul (kloneringsvector) om een nieuw recombinant DNA-molecuul te vormen.② Het recombinant-DNA-molecuul wordt overgebracht naar de ontvangende cel en gerepliceerd in de ontvangende cel.Dit proces wordt transformatie genoemd.③ Screen en identificeer de ontvangende cellen die het recombinant-DNA hebben geabsorbeerd.④Cultiveer de cellen die recombinant DNA in grote hoeveelheden bevatten om te detecteren of het buitenlandse hulpgen tot expressie wordt gebracht.
13. Er zijn twee soorten plasmidereplicatie: degenen die strikt worden gecontroleerd door de eiwitsynthese van de gastheercel worden (strakke plasmiden) genoemd, en degenen die niet strikt worden gecontroleerd door de eiwitsynthese van de gastheercel worden (ontspannen plasmiden) genoemd.
14. Het PCR-reactiesysteem moet aan de volgende voorwaarden voldoen:DNA-primers (ongeveer 20 basen) met complementaire sequenties aan elk uiteinde van de twee strengen van het doelgen dat moet worden gescheiden.B.Enzymen met thermische stabiliteit zoals: TagDNA-polymerase.c, dNTPd, DNA-sequentie van belang als sjabloon
15. Het basisreactieproces van PCR omvat drie fasen: (denaturatie), (gloeien) en (extensie).
16. Het basisproces van transgene dieren omvat gewoonlijk: ①Introductie van een gekloond vreemd gen in de kern van een bevruchte eicel of embryonale stamcel;②Transplantatie van de geïnoculeerde bevruchte eicel of embryonale stamcel in de vrouwelijke baarmoeder;③ Volledige embryonale ontwikkeling en groei Voor de nakomelingen met vreemde genen;④ Gebruik deze dieren die vreemde eiwitten kunnen produceren als fokdieren om nieuwe homozygote lijnen te fokken.
17. Hybridoomcellijnen worden gegenereerd door (milt B) cellen te hybridiseren met (myeloom) cellen, en aangezien (miltcellen) hypoxanthine kunnen gebruiken en (botcellen) celdelingsfuncties bieden, kunnen ze worden gekweekt in HAT-medium.groeien.
18. Met de verdieping van het onderzoek wordt de eerste generatie antilichamen genoemd (polyklonale antilichamen), de tweede generatie (monoklonale antilichamen) en de derde generatie (genetische manipulatie-antilichamen).
19. Momenteel is de genetische manipulatie van insectenvirussen voornamelijk gericht op baculovirus, wat tot uiting komt in de introductie van (exogeen toxine-gen);(genen die de normale levenscyclus van insecten verstoren);(modificatie van virusgenen).
20. De trans-werkende eiwitfactoren die overeenkomen met de gemeenschappelijke elementen TATA, GC en CAAT in de zoogdier-RNA-polymerase II-promoter zijn respectievelijk (TFIID), (SP-1) en (CTF/NF1).
eenentwintig.De basistranscriptiefactoren van RNA-polymerase Ⅱ zijn TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, en hun bindingsvolgorde is: (D, A, B, E).Waarin de functie van TFII-D is (binding aan TATA box).
tweeëntwintig.De meeste transcriptiefactoren die aan DNA binden, werken in de vorm van dimeren.De functionele domeinen van transcriptiefactoren die aan DNA binden, zijn gewoonlijk de volgende (helix-draai-helix), (zinkvingermotief), (basis-leucine) ritsmotief).
drieëntwintig.Er zijn drie soorten restrictie-endonuclease-splitsingsmodi: (gesneden aan de 5'-zijde van de symmetrie-as om 5'-kleverige uiteinden te genereren), (gesneden aan de 3'-zijde van de symmetrie-as om 3'-kleverige uiteinden te genereren (gesneden aan de symmetrie-as om platte segmenten te genereren)).
vierentwintig.Plasmide-DNA heeft drie verschillende configuraties: (SC-configuratie), (oc-configuratie), (L-configuratie).De eerste in elektroforese is (SC-configuratie).
25. Exogene genexpressiesystemen, voornamelijk (Escherichia coli), (Gist), (Insect) en (Zoogdierceltabel).
26. De meest gebruikte methoden voor transgene dieren zijn: (retrovirale infectiemethode), (DNA-micro-injectiemethode), (embryonale stamcelmethode).
Toepassing Moleculaire biologie
1. Noem de functies van meer dan 5 RNA's?
Overdracht RNA tRNA Overdracht aminozuur Ribosoom RNA rRNA Ribosoom vormt boodschapper RNA mRNA Eiwitsynthese sjabloon Heterogeen nucleair RNA hnRNA Voorloper van volwassen mRNA klein nucleair RNA snRNA Betrokken bij hnRNA-splitsing Klein cytoplasmatisch RNA scRNA/7SL-RNA-eiwit Plasmareticulum-gelokaliseerde en gesynthetiseerde signaalherkenning lichaamscomponenten Antisense RNA anRNA/micRNA Reguleert genexpressie Ribozym RNA Enzymatisch actief RNA
2. Wat is het belangrijkste verschil tussen prokaryote en eukaryotische promoters?
Prokaryote TTGACA --- TATAAT------Initiatieplaats-35 -10 Eukaryotische versterker---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Initiatieplaats-110 -70 -25
3. Wat zijn de belangrijkste aspecten van kunstmatige constructie van natuurlijke plasmiden?
Natuurlijke plasmiden hebben vaak defecten en zijn daarom niet geschikt als drager voor genetische manipulatie en moeten worden gemodificeerd en geconstrueerd:Voeg geschikte selectiemerkergenen toe, zoals twee of meer, die gemakkelijk te gebruiken zijn voor selectie, meestal antibiotische genen.B.Verhoog of verlaag geschikte enzymknipplaatsen om recombinatie te vergemakkelijken.C.Verkort de lengte, snijd onnodige fragmenten af, verbeter de importefficiëntie en verhoog de laadcapaciteit.D.Verander de replicacon, van strak naar los, van minder exemplaren naar meer exemplaren.e.Voeg speciale genetische elementen toe volgens de speciale vereisten van genetische manipulatie
4. Geef een voorbeeld van een methode voor differentiële screening van weefselspecifiek cDNA?
Er worden twee celpopulaties bereid, het doelgen wordt tot expressie gebracht of in hoge mate tot expressie gebracht in een van de cellen, en het doelgen wordt niet of slechts in geringe mate tot expressie gebracht in de andere cel, en vervolgens wordt het doelgen gevonden door hybridisatie en vergelijking.Tijdens het ontstaan en de ontwikkeling van tumoren zullen tumorcellen bijvoorbeeld mRNA's presenteren met andere expressieniveaus dan normale cellen.Daarom kunnen tumorgerelateerde genen worden uitgescreend door middel van differentiële hybridisatie.De inductiemethode kan ook worden gebruikt om de genen uit te filteren waarvan de expressie wordt geïnduceerd.
5. Genereren en screenen van hybridomacellijnen?
Milt B-cellen + myeloomcellen, voeg polyethyleenglycol (PEG) toe om celfusie te bevorderen, en de milt B-myeloomfusiecellen gekweekt in HAT-medium (met hypoxanthine, aminopterine, T) blijven voeden.De celfusie bevat: milt-miltfusiecellen: niet in staat om te groeien, miltcellen kunnen niet in vitro worden gekweekt.Bot-botfusiecellen: kunnen hypoxanthine niet gebruiken, maar kunnen purine synthetiseren via de tweede route met behulp van folaatreductase.Aminopterine remt foliumzuurreductase en kan dus niet groeien.Bot-miltfusiecellen: kunnen groeien in HAT, miltcellen kunnen hypoxanthine gebruiken en botcellen zorgen voor een celdelingsfunctie.
6. Wat is het principe en de methode voor het bepalen van de primaire structuur van DNA met behulp van de dideoxyterminale terminatiemethode (Sanger-methode)?
Het principe is om een nucleotideketenbeëindiger te gebruiken - 2,,3,-dideoxynucleotide om de verlenging van DNA te beëindigen.Omdat het de 3-OH mist die nodig is voor de vorming van 3/5/fosfodiësterbindingen, kan de DNA-keten, eenmaal opgenomen in de DNA-keten, niet verder worden verlengd.Volgens het principe van basenparing, wanneer DNA-polymerase dNMP nodig heeft om deel te nemen aan de normaal verlengde DNA-keten, zijn er twee mogelijkheden: de ene is om deel te nemen aan ddNTP, wat resulteert in de beëindiging van de deoxynucleotide-ketenverlenging;de andere is om deel te nemen aan dNTP, zodat de DNA-keten zich nog kan uitbreiden tot de volgende ddNTP wordt ingebouwd.Volgens deze methode kan een groep DNA-fragmenten van verschillende lengte worden verkregen die eindigen op ddNTP.De methode is om in vier groepen te verdelen, respectievelijk ddAMP, ddGMP, ddCMP en ddTMP.Na de reactie kan polyacrylamidegelelektroforese de DNA-sequentie lezen volgens de zwembanden.
7. Wat is het positieve regulatie-effect van activatorproteïne (CAP) op transcriptie?
Cyclisch adenylaat (cAMP)-receptoreiwit CRP (cAMP-receptoreiwit), het complex gevormd door de combinatie van cAMP en CRP wordt CAP (cAMP-geactiveerd eiwit) genoemd.Wanneer E. coli wordt gekweekt in een medium zonder glucose, neemt de synthese van CAP toe en heeft CAP de functie om promotors zoals lactose (Lac) te activeren.Sommige CRP-afhankelijke promoters missen de typische -35 region sequence feature (TTGACA) die gewone promoters hebben.Daarom is het moeilijk voor RNA-polymerase om eraan te binden.De aanwezigheid van CAP (functie): kan de bindingsconstante van enzym en promotor aanzienlijk verbeteren.Het toont voornamelijk de volgende twee aspecten: ① CAP helpt het enzymmolecuul zich correct te oriënteren door de conformatie van de promotor en de interactie met het enzym te veranderen, om te combineren met het -10-gebied en de rol te spelen van het vervangen van de functie van het -35-gebied.②CAP kan ook de binding van RNA-polymerase aan andere plaatsen in DNA remmen, waardoor de kans op binding aan zijn specifieke promotor toeneemt.
8. Welke stappen zijn gewoonlijk opgenomen in een typisch DNA-recombinatie-experiment?
A.Extraheer het doelgen (of exogeen gen) van het donororganisme en verbind het enzymatisch met een ander DNA-molecuul (kloneringsvector) om een nieuw recombinant DNA-molecuul te vormen.B.Breng het recombinante DNA-molecuul over in de ontvangende cel en repliceer en bewaar het in de ontvangende cel.Dit proces wordt transformatie genoemd.C.Screen en identificeer die ontvangende cellen die het recombinant-DNA hebben geabsorbeerd.D.Massacultuur van de cellen die het recombinante DNA bevatten om te detecteren of het gen voor vreemde hulp tot expressie wordt gebracht.
9. Constructie van genenbibliotheek Drie methoden voor het screenen van recombinanten worden gegeven en het proces wordt kort beschreven.
Antibioticaresistentiescreening, insertie-inactivatie van resistentie, blauw-wittevlekscreening of PCR-screening, differentiële screening, DNA-sonde De meeste kloneringsvectoren dragen antibioticaresistentiegenen (anti-ampicilline, tetracycline).Wanneer het plasmide wordt overgebracht naar Escherichia coli, krijgen de bacteriën resistentie en degenen zonder overdracht zullen geen resistentie hebben.Maar het kan niet onderscheiden of het is gereorganiseerd of niet.Als in een vector die twee resistentiegenen bevat, een vreemd DNA-fragment in een van de genen wordt ingebracht en ervoor zorgt dat het gen wordt geïnactiveerd, kunnen twee plaatcontroles met verschillende geneesmiddelen worden gebruikt om te screenen op positieve recombinanten.Het pUC-plasmide bevat bijvoorbeeld het LacZ-gen (coderend voor β-galactosidase), dat het chromogene substraat X-gal (5-broom-4-chloor-3-indool-β-D-galactoside) kan ontleden om blauw te produceren, waardoor de stam blauw wordt.Wanneer het vreemde DNA is ingebracht, kan het LacZ-gen niet tot expressie worden gebracht en is de stam wit om de recombinante bacteriën te screenen.
10. Verklaar het basisproces van het verkrijgen van transgene dieren door middel van embryonale stamcellen?
Embryonale stamcellen (ES) zijn embryonale cellen tijdens de embryonale ontwikkeling, die kunstmatig kunnen worden gekweekt en vermeerderd en de functie hebben om zich te differentiëren in andere celtypen.Cultuur van ES-cellen: de binnenste celmassa van de blastocyst wordt geïsoleerd en gekweekt.Wanneer ES wordt gekweekt in een feeder-vrije laag, zal het differentiëren in verschillende functionele cellen zoals spiercellen en N-cellen.Wanneer gekweekt in een medium dat fibroblasten bevat, zal ES de differentiatiefunctie behouden.ES kan genetisch worden gemanipuleerd en de differentiatiefunctie kan worden geïntegreerd zonder de differentiatiefunctie aan te tasten, wat het probleem van willekeurige integratie oplost.Introduceer exogene genen in embryonale stamcellen, implanteer ze vervolgens in de baarmoeder van zwangere vrouwelijke muizen, ontwikkel ze tot jongen en kruis ze om homozygote muizen te verkrijgen.
