Escherichia Coli O157: H7-nucleïnezuurdetectiekit (PCR Fluorescent Probe-methode/Lyofilisatie)
Kitbeschrijving:
Kat Nee.FP103
Het wordt gebruikt voor snelle detectie en screening van E. coli O157:H7 in voedsel-, voer-, watermonsters en milieumonsters.
Beschrijvingen
Je gebruikt het voorsnelle detectie en screening van E. coli O157:H7 in voedsel-, voer-, watermonsters en milieumonsters.
[Testprincipe]
Volgens het principe van fluorescerende PCR-technologie worden specifieke primers en Taqman-sondes ontworpen voor het specifieke gen van Escherichia coli O157: H7, en gedetecteerd door een fluorescerend PCR-instrument, om de detectie van Escherichia coli O157: H7 Kwalitatieve detectie van DNA te realiseren.
Inhoud pakket
Opmerking: ROX-kanaalsonde is niet inbegrepen.
| Ccomponenten | Specificatie | Quantiteit |
| Buffer A | Buis | 1 |
| buffer B | Buis | 1 |
| Positieve controle | Buis | 1 |
| Negatieve controle | Buis | 1 |
Verwacht gebruik
Je gebruikt het voor snelle detectie en screening van E. coli O157:H7 in voedsel-, voer-, watermonsters en milieumonsters.
Opslagcondities en vervaldatum
Bewaar bij -20℃ in het donker en vermijd herhaald invriezen en ontdooien.
De geldigheidsduur is 12maanden en de productiedatum staat op de buitenverpakking.
Instrumenten En Verbruiksartikelen
Fluorescerend kwantitatief PCR-instrument, pipetpistool en bijpassende tips, vortexschudder, minicentrifuge.
Gebruik
1. Voorbeeldverwerking
1.1 Type monster: Deze kit is geschikt voor voedsel-, voer-, watermonsters en andere monsters waarvan wordt vermoed dat ze besmet zijn met Escherichia coli O157:H7.Voor diepverwerkte vleesproducten, dranken en andere substanties die pigmenten bevatten, moeten ze worden gespoeld om te voorkomen dat de fluorescentiesignaalverzameling wordt beïnvloed.
1.2 Monsterverwerking: Raadpleeg "GB 4789.10-2016 Food Safety National Standard Food Microbiological Examination of Escherichia coli O157: H7 Test" voor monstervoorbereiding, verrijkingscultuur en isolatie van Escherichia coli O157: H7.
- Nucleïnezuur extractie
Neem 20 ml verrijkingsoplossing in een centrifugebuis van 1,5 ml, voeg 200 μl microbieel lysaat toe (extra kit is vereist), vortex gedurende 30 seconden, centrifugeer kort en zet opzij.
Opmerkingen: De extractie van nucleïnezuur uit het lysaat moet binnen 10 minuten worden voltooid en kan niet lang worden bewaard.
3. Nucleïnezuur amplificatie
3.1 Schakel het fluorescerende kwantitatieve PCR-instrument in voor gebruik.
Buffer A en Buffer B uit de kit, smelt ze grondig en centrifugeer kort.Voeg 18 μL Buffer A en 2 μL Buffer B toe aan elk PCR-reactiebuisje.Voeg vervolgens 5 ml van elk van de negatieve controle, het geëxtraheerde nucleïnezuur en de positieve controle toe aan de PCR-reactiebuisjes, sluit de buisjes af met een dop en centrifugeer kort.
3.3 Breng de PCR-reactiebuis over naar een fluorescerende PCR-machine en gebruik de volgende procedures om amplificatie-experimenten uit te voeren: selecteer 25 ml voor het reactiesysteem, verzamel fluorescentiesignalen bij 60°C voor elke cyclus en selecteer FAM voor het detectiekanaal.
| Stap | Programma | Aantal cycli |
| 1 | 37℃ 5min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ jaren '30 (verzamel fluorescentie) |
Handleidingen voor probleemanalyse
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Er kan geen RNA worden geëxtraheerd of de opbrengst aan nucleïnezuur is laag
Er zijn meestal veel factoren die de efficiëntie van het herstel beïnvloeden, zoals: RNA-gehalte van het monster, werkwijze, elutievolume, enz.
Analyse van veelvoorkomende oorzaken:
1. IJsbad of centrifugatie bij lage temperatuur (4 ° C) tijdens bedrijf.
Suggestie: werking bij kamertemperatuur (15-25 ° C), nooit ijsbad en centrifuge bij lage temperatuur.
2. Onjuiste of te lange monsteropslag.
Suggestie: bewaar monsters bij -80 ° C of vries ze in vloeibare stikstof in en vermijd herhaaldelijk gebruik van bevriezen en ontdooien;probeer vers verzamelde monsters te gebruiken voor RNA-extractie.
3.Onvoldoende monsterlysis
Aanbeveling: Zorg ervoor dat het monster en de werkoplossing (lineair acrylamide) grondig zijn gemengd en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (15-25 ° C) zijn geïncubeerd.
4. Het eluens is verkeerd toegevoegd
Aanbeveling: Zorg ervoor dat RNase-Free ddH2O wordt toegevoegd in het midden van het membraan van de zuiveringskolom
5. Onjuist volume watervrije ethanol in buffer viRW2
Suggestie: volg de instructies, voeg het juiste volume watervrije ethanol toe aan Buffer viRW2 en meng ze goed voordat u de kit gebruikt。
6. Onjuist monstergebruik.
Suggestie: 200 µl monster per 500 µl Buffer viRL.Overmatig monstervolume zal resulteren in een verminderde RNA-extractiesnelheid.
7. Onjuist elutievolume of onvolledige elutie.
Suggestie: Het eluensvolume van de zuiveringskolom is 30-50μl;als het elutie-effect niet bevredigend is, wordt aanbevolen voorverwarmde RNase-Free ddH toe te voegen2O en verleng de tijd bij kamertemperatuur, zoals 5-10min
8. Zuiveringskolom bevat ethanolresidu na spoelen in Buffer viRW2.
Suggestie: Als er nog steeds ethanol achterblijft na spoelen in buffer viRW2 en centrifugeren met lege buis gedurende 2 minuten, kan de zuiveringskolom na centrifugeren met lege buis 5 minuten op kamertemperatuur worden gelaten om de resterende ethanol volledig te verwijderen.
De afbraak van gezuiverde RNA-moleculen
De kwaliteit van het gezuiverde RNA is gerelateerd aan factoren zoals monsteropslag, RNase-besmetting en werking.
Analyse van veelvoorkomende oorzaken:
1. De verzamelde monsters zijn niet op tijd opgeslagen.
Suggestie: als het monster na verzameling niet op tijd wordt gebruikt, bewaar het dan onmiddellijk bij -80 ℃ of vloeibare stikstof.Probeer voor de extractie van RNA-moleculen waar mogelijk vers verzamelde monsters te gebruiken.
2.Verzamelde monsters waren herhaaldelijk aan het bevriezen en ontdooien.
Suggestie: Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien (niet meer dan één keer) tijdens het verzamelen en bewaren van monsters, anders zal de opbrengst aan nucleïnezuur afnemen.
3.RNase werd in de operatiekamer geïntroduceerd of er werden geen wegwerphandschoenen, maskers enz. gedragen.
Suggestie: het experiment met extractie van RNA-moleculen kan het beste worden uitgevoerd in een aparte RNA-operatiekamer en de experimentele tafel wordt vóór het experiment schoongemaakt.Draag tijdens het experiment wegwerphandschoenen en -maskers om RNA-afbraak veroorzaakt door RNase-introductie te voorkomen.
4. Het reagens wordt tijdens het gebruik verontreinigd door RNase.
Suggestie: Vervang door nieuwe Viral RNA Isolation Kit voor gerelateerde experimenten.
5. De RNase-verontreiniging van de centrifugebuisjes, pipetpunten enz. Suggestie: Zorg ervoor dat de centrifugebuisjes, pipetpunten en pipetten allemaal RNase-vrij zijn.
De gezuiverde RNA-moleculen beïnvloedden stroomafwaartse experimenten
De RNA-moleculen die door de zuiveringskolom worden gezuiverd, zullen downstream-experimenten beïnvloeden als er te veel zoutionen of eiwitten zijn, zoals: reverse transcriptie, Northern Blot, enz..
1. Er zijn achtergebleven zoutionen in de geëlueerde RNA-moleculen.
Aanbeveling: Zorg ervoor dat het juiste volume watervrije ethanol is toegevoegd aan Buffer viRW2 en was de zuiveringskolom twee keer volgens de juiste centrifugatiesnelheid in de gebruiksaanwijzing.Voer vervolgens centrifugatie uit om verontreiniging met zoutionen zoveel mogelijk te verwijderen
2. Er is resterende ethanol in de geëlueerde RNA-moleculen
Suggestie: zodra u heeft bevestigd dat de zuiveringskolommen zijn gespoeld door Buffer viRW2, voert u een lege-buiscentrifugering uit volgens de centrifugale snelheid in de gebruiksaanwijzing.Als er nog ethanol over is, kan deze na centrifugatie met een lege buis 5 minuten bij kamertemperatuur worden bewaard om de resterende ethanol zoveel mogelijk te verwijderen.
Handleidingen:
Instructiehandleiding virale RNA-isolatiekit
