We zijn ervaren fabrikant.Wint de meerderheid in de cruciale certificeringen van zijn markt voor grote kortingen China High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Kwaliteit is het leven in de fabriek, Focus op de vraag van de klant is de bron van overleving en ontwikkeling van het bedrijf. We houden ons aan eerlijkheid en goede trouw werkhouding, kijken uit naar uw komst!
We zijn ervaren fabrikant.Wint de meerderheid in de cruciale certificeringen van zijn markt voorChina Taq DNA-polymerase, Qpcr, Ons bedrijf belooft: redelijke prijzen, korte productietijd en bevredigende after-sales service, we heten u ook van harte welkom om onze fabriek te bezoeken wanneer u maar wilt.Wens nu dat we samen een prettige en langdurige onderneming hebben !!!

Beschrijvingen

Deze kit maakt gebruik van een uniek lysisbuffersysteem dat snel RNA uit gekweekte celmonsters kan vrijmaken voor RT-qPCR-reacties, waardoor het tijdrovende en arbeidsintensieve RNA-zuiveringsproces wordt geëlimineerd.De RNA-template kan in slechts 7 minuten worden verkregen.De 5×Direct RT Mix en 2×Direct qPCR Mix-SYBR-reagentia die door de kit worden geleverd, kunnen snel en effectief real-time kwantitatieve PCR-resultaten verkrijgen.

5×Direct RT Mix en 2×Direct qPCR Mix-SYBR hebben een sterke remmertolerantie en het lysaat van de monsters kan rechtstreeks als sjabloon voor RT-qPCR worden gebruikt.Deze kit bevat de unieke RNA Foregene reverse transcriptase met hoge affiniteit en Hot D-Taq DNA-polymerase, dNTP's, MgCl₂, reactiebuffer, PCR-optimizer en stabilisator.

Specificaties

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Kit-componenten

Kenmerken&voordelen

■ Eenvoudig en effectief: met Cell Direct RT-technologie kunnen RNA-monsters in slechts 7 minuten worden verkregen.

■ De vraag naar monsters is klein, er kunnen slechts 10 cellen worden getest.

■ Hoge verwerkingscapaciteit: het kan snel RNA detecteren in cellen gekweekt in platen met 384, 96, 24, 12, 6 putjes.

■ DNA Eraser kan vrijgegeven genomen snel verwijderen, waardoor de impact op latere experimentele resultaten aanzienlijk wordt verminderd.

■ Geoptimaliseerd RT- en qPCR-systeem maakt de tweestaps RT-PCR reverse transcriptie efficiënter en PCR specifieker en beter bestand tegen RT-qPCR-reactieremmers.

Kit-applicatie

Toepassingsgebied: gekweekte cellen.

- RNA vrijgegeven door monsterlysis: alleen van toepassing op de RT-qPCR-template van deze kit.

- De kit kan voor de volgende doeleinden worden gebruikt: analyse van genexpressie, verificatie van het door siRNA gemedieerde genuitschakelingseffect, screening van geneesmiddelen, enz.

Diagram

Opslag en houdbaarheid

Deel I van deze kit moet worden bewaard bij 4 ℃;Deel II zou bij -20℃ moeten worden bewaard.

Foregene Protease Plus II moet worden bewaard bij 4 ℃, niet bevriezen bij -20 ℃.

Reagens 2×Direct qPCR Mix-SYBR moet in het donker bij -20 ℃ worden bewaard;indien vaak gebruikt, kan het ook worden bewaard bij 4 ℃ voor opslag op korte termijn (gebruik binnen 10 dagen). We zijn een ervaren fabrikant.Wint de meerderheid in de cruciale certificeringen van zijn markt voor grote kortingen China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, kwaliteit is het leven in de fabriek, focus op de vraag van de klant is de bron van overleving en ontwikkeling van het bedrijf, we houden ons aan eerlijkheid en goede trouw werkhouding, kijken uit naar uw komst!
Grote kortingenChina Taq DNA-polymerase, Qpcr, Ons bedrijf belooft: redelijke prijzen, korte productietijd en bevredigende after-sales service, we heten u ook van harte welkom om onze fabriek te bezoeken wanneer u maar wilt.Wens nu dat we samen een prettige en langdurige onderneming hebben !!!

QuickEzoTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.nr.DRT-01021/01022

Voor celdirecte RT-qPCR met ≤ 1000.000 cellen

Product Introductie

Dit product maakt gebruik van een uniek lysisbuffersysteem om snel RNA vrij te maken uit gekweekte celmonsters voor RT-qPCR-reacties, waardoor het tijdrovende en arbeidsintensieve RNA-zuiveringsproces wordt geëlimineerd, en slechts 7 minuten om de vereiste RNA-template te verkrijgen, met de 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman geleverd door de kit kan snel en efficiënt real-time kwantitatieve PCR-resultaten verkrijgen.

5× Direct RT Mix en 2× Direct qPCR Mix-Taqman hebben een sterke remmertolerantie en kunnen efficiënte omkering en specifieke amplificatie uitvoeren met behulp van het lysaat van het te meten monster als sjabloon.Het reagens bevat Foregene reverse transcriptase, Hot D-Taq DNA-polymerase, dNTP's, MgCl₂, reactiebuffer, PCR-optimizer en stabilisator, die kunnen worden gebruikt met lysisbuffer om monsters snel en gemakkelijk te detecteren, en heeft de kenmerken van hoge gevoeligheid, specificiteit en stabiliteit.

Producteigenschappen

Eenvoudige, effectieve Cell Direct RT-technologie die slechts 7 minuten nodig heeft om RNA-monsters te verkrijgen.

De monstervereisten zijn klein en er kunnen minimaal 10 gekweekte cellen worden gebruikt voor experimenten.

Hoge doorvoer voor snelle RNA-acquisitie van gekweekte cellen zoals platen met 384, 96, 24, 12 en 6 putjes.

DNA Eraser kan vrijgekomen genomen snel verwijderen, waardoor de impact op latere experimentele resultaten aanzienlijk wordt verminderd.

Geoptimaliseerde RT- en qPCR-systemen maken RT-PCR in twee stappen mogelijk met efficiëntere reverse transcriptie, specificiteit en sterkere RT-qPCR-reactieremmertolerantie.

Kit-applicatie

Toepassingsgebied: Gekweekte cellen.

Monsterlysis geïnterpreteerd RNA: alleen gebruikt als een tweestaps RT-qPCR-template.

Kits kunnen voor de volgende doeleinden worden gebruikt: analyse van genregulatie-expressie, alleltesten, screening op geneesmiddelen, enz.

Kit beperkingen

Versterkte fragmenten ≤ 300 bp.

Kits worden gebruikt om cellen vers te kweken.

Controle van de productkwaliteit

Volgens het Total Quality Management System van FOREGENE wordt elke batch kits uit de Cell Direct RT-qPCR-serie meerdere keren grondig getest om de betrouwbaarheid en stabiliteit van de kwaliteit van elke batch kits te garanderen.

Inhoud pakket

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman kunnen afzonderlijk worden aangeschaft, details zijn te vinden in Bijlage 1 (PAGINA 13).

Opslag condities

1. Verzendvoorwaarden

Het hele proces van transport van ijspakboxen bij lage temperatuur, om ervoor te zorgen dat de kit zich in een staat van <4 °C bevindt.

2. Bewaarcondities

Bewaar deel I bij 4°C en deel II bij -20°C.

De Foregene Protease Plus II moet worden bewaard bij 4°C, niet ingevroren bij -20°C.

Reagens 2× Direct qPCR Mix-Taqman wordt bewaard bij -20°C, of ​​bij 4°C voor kortdurend gebruik bij frequent gebruik (binnen 10 dagen).

Informatie over kitcomponenten

Buffer CL: Biedt de omgeving die nodig is voor cellysisreacties.

Buffer ST: beëindigt de werkzame stof in het lysaat om effecten op daaropvolgende RT te voorkomen.

DNA Eraser: DNA-verwijderaar, het effect van het verwijderen van het genoom op volgende experimenten.

5× Direct RT Mix: Bevat Foregene Reverse Transcriptase met hoge RNA-affiniteit, RNase-remmer, dNTP's, stabilisatoren, versterkers, optimizers en reverse transcriptieprimers voor optimale uitlijning (Random Primer, Oligo(dT)₁₈primer).

Foregene Protease Plus II: In de context van lysisbuffer worden cellen gelyseerd om nucleïnezuren vrij te maken.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: dit reagens bevat Hot D-Taq DNA-polymerase, dNTP's, MgCl₂, reactiebuffer, PCR-optimizer en stabilisator.

20 × ROX-referentiekleurstof: wordt over het algemeen gebruikt op real-time PCR-amplificatie-instrumenten van ABI, Stratagene en andere bedrijven. Het wordt gebruikt om het verschil aan te passen tussen PCR-buizen en buizen veroorzaakt door PCR-doseringsfouten.De 20 × ROX-referentiekleurstofconcentratie die vereist is voor verschillende instrumenten is verschillend en de gebruiker kan deze toevoegen volgens de aanbevolen concentratie van het instrument.

RNase-vrij ddH₂O: RNase-vrij gesteriliseerd ultrapuur water voor tweestaps RT-qPCR-reacties.

Voorzorgsmaatregelen:(Zorg ervoor dat u de voorzorgsmaatregelen zorgvuldig leest voordat u de kit gebruikt)

Besteed aandacht aan de werkingsmethode van het experiment om kruisbesmetting tussen monsters te voorkomen.

Besteed aandacht aan de netheid van de experimentele omgeving en gebruiksvoorwerpen om RNase-besmetting en RNA-degradatie te voorkomen.

Neem verse of goed bewaarde celmonsters en gebruik nooit herhaalde gevriesdroogde celmonsters.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman moet herhaaldelijk invriezen en ontdooien voorkomen, anders heeft dit invloed op reverse transcriptie en PCR-efficiëntie.

Voorbereidingrantsoenenvooroperatie

Zorg ervoor dat u de instructies aandachtig leest voordat u deze kit gebruikt.De Cell Direct RT-qPCR-kit is eenvoudig, handig en snel te bedienen, en de instructies geven volledige informatie over de volledige kit en hoe deze correct te gebruiken.Bereid voor gebruik de benodigde experimentele materialen en apparatuur voor.

Experimentele materialen en apparatuur

◆ Kweekcellen.

◆ 1,5 ml of 2 ml, RNase-/DNase-Free centrifugebuis, RNase-/DNase-Free tip, 0,2 ml steriele qPCR-buis.

◆ qPCR-machine, pipet, tafelcentrifuge (≥13.400×g) (afhankelijk van experimentele behoeften), etc.

Veiligheid

◆ Dit product is alleen bedoeld voor wetenschappelijk onderzoek, gebruik het niet voor farmaceutische, klinische, voedsel- en cosmetische doeleinden.

◆ Draag bij het gebruik van chemicaliën geschikte laboratoriumkleding, handschoenen, veiligheidsbril etc.

Operatiegidsen

Cell Lysis-systemen, RT-systemen en supplementpakketten met qPCR-reactieoplossing kunnen afzonderlijk worden aangeschaft, voor details in Bijlage 1 (PAGINA 13).

Operatie gids

A: Voorbeeld van RNA-afgifte

1. Cellen werden voorbehandeld: was de celkweekplaat met koude PBS, lyseer vervolgens de cellen (10-10⁶), 10⁶ dan het aantal cellen, wordt aanbevolen Foregene the Cell and RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) of Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) voor RNA-extractie en -zuivering.

1.1.Hechtende cellen (plaat met 24 putjes als voorbeeld)

1.1.1.Bepaal het aantal cellen in elk putje, bepaal dat het aantal cellen 1 × 10 is⁵en gebruik een pipet om het kweekmedium uit de kweekschaal te verwijderen.

1.1.2.Voeg aan elk putje 200 μl voorgekoelde 1 × PBS toe.Pipetteer niet herhaaldelijk en verwijder PBS uit de putjes.Kantel de plaat en verwijder zoveel mogelijk PBS.Ga verder met stap 2.

1.1.3.Een andere celkweekschaal of een referentienummertabel 1-1 in een celkweekschaal werd voorgekoeld 1 x PBS toegevoegd voor het wassen van cellen.

Tabel 1-1: PBS-dosering voor verschillende aantallen cellen

Opmerking：Om een ​​stevig hechtende cellen te verzekeren，een groot aantal celverlies vermeden bij het wassen.

1.2.Suspensiecellen of hechtende cellen gekweekt in niet-poreuze platen

1.2.1.Hechtende cellen gekweekt in niet-multiputplaten (suspensiecellen starten vanaf de volgende stap 1.2.2), verzamel en scheid de cellen volgens de normale celverzamelmethode en plaats ze in een kweekplaat of centrifugebuis;als trypsinisatie wordt gebruikt, is centrifugeren vereist om de cellen te verzamelen en resterende trypsine te verwijderen, toegevoegde PBS-geresuspendeerde cellen in individuele cellen om de cellen te dispergeren.

1.2.2.Na het aantal getelde cellen, verdeelde cellen 1 × 10⁵ één om buizen te centrifugeren, verzamel cellen door centrifugatie bij 1000 × g gedurende 10 minuten.

1.2.3.Voeg 200 μl PBS toe aan de centrifugebuis, niet herhaaldelijk pipetteren en zuig de PBS direct op.ga verder met stap 2. (Als het moeilijk is om te precipiteren en de cellen opnieuw zijn gesuspendeerd, kan 1000 x g worden gecentrifugeerd 10 minuten na het weggooien van het supernatant, de celpellet gaat verder met stap 2)

2.Cellysis: Verwijder Buffer CL, waarvan de temperatuur in evenwicht is gebracht met kamertemperatuur, DNA Eraser en Foregene Protease Plus II, volgens de volgende tabel 1-2 voorbereid lysissysteem: (Lysis-oplossing is klaar voor gebruik).

Tabel 1-2: decolleté systeemvoorbereiding (Let op: bij de bereiding op ijs)

3. (plaat met 24 putjes als voorbeeld) Pipetteer 200 μl mastermix voor cellysis in elk putje, blaas herhaaldelijk 5-10 keer, incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (20-25 ℃).

Opmerking：Om de vorming van bellen te voorkomen, moet u bij het pipetteren de pipetschaal aanpassen aan 200 μl of minder.De cellen kunnen na lysis troebel lijken, wat normaal is.

4. (plaat met 24 putjes als voorbeeld) wordt toegevoegd aan de vloeistof 20 μl Buffer ST (verschillende lysissystemen Buffer ST toegevoegd in een hoeveelheid weergegeven in Tabel 1-3), 5-10 keer herhaald pipetteren, bij kamertemperatuur (20-25 ℃) werden gedurende 2 minuten geïncubeerd.

Opmerking：De pipetpunt bevindt zich onder het oppervlak, zodat het lysaat wordt toegevoegd，om de vorming van luchtbellen te voorkomen, moet u bij het pipetteren de pipetschaal aanpassen aan 200 μl of minder.

Tabel 1-3：Buffer-ST toevoegen

5. Het lysaat wordt gebruikt voor daaropvolgende RT-qPCR-experimenten.Als de daaropvolgende experimenten niet op tijd kunnen worden uitgevoerd, bewaar het dan niet langer dan 2 uur op ijs en bewaar het bij -20 ℃ of -80 ℃ (niet langer dan drie maanden).

B: RT-systeemvoorbereiding

1. Neem 5 × Direct RT Mix eruit en plaats het op een ijsbad, laat het op natuurlijke wijze smelten en meng het voorzichtig voor later gebruik;haal RNase-Free ddH2O eruit en smelt het en plaats het op een ijsbad voor later gebruik.Bereid het reactiesysteem op ijs volgens tabel 2-1 hieronder.

Tabel 2-1: Bereiding van RT-reactiesysteem

2. Na voltooiing van de formulering van het systeem voorzichtig gemengd en kort gecentrifugeerd in de volgende tabel 2 -2 reactieomstandigheden RT-reactie.

Tabel 2-2: Instelling RT-reactieconditie

3. Na voltooiing van de reactie werd het reactieproduct direct op ijs geplaatst voor qPCR, plaats de langdurige bewaring -20 ℃ of -80 ℃.

Opmerking: Door het gebruik van niet-gezuiverde template kunnen er witte neerslagen verschijnen in het reverse transcriptieproduct.Dit is een normaal verschijnsel.Centrifugeer het supernatant onmiddellijk voor volgende experimenten.

De resulterende RT-reactieoplossing wordt toegevoegd aan de volgende stap Real Time PCR-reactiesystemen, het wordt aanbevolen om hoeveelheden toe te voegen variërend van 10-30% van het reactiesysteem.

C: voorbereiding van het qPCR-reactiesysteem

1. Geschikte hoeveelheid B bereid in stap cDNA-template volgens de volgende tabel 3-1 om een ​​reactiesysteem te bereiden.

Opmerking: de hoeveelheid cDNA-template is goed voor 10-30% van het qPCR-systeem.Voeg bijvoorbeeld in een qPCR-systeem van 20 μl 2-6 μl lysisbuffer toe, maar niet meer dan 6 μl.

2. De optimalisatie van goede qPCR-omstandigheden (gloeitemperatuur, enz.) voor qPCR-reactie (de reactieomstandigheden gegeven in tabel 3-2).

Opmerking: probeer geoptimaliseerde omstandigheden voor qPCR-reacties te gebruiken om betere resultaten te krijgen.

Tabel 3-1: Voorbereiding van het PCR-reactiesysteem

1*: Primerconcentratie kan worden aangepast binnen het bereik van 50-900 nM wanneer de prestaties van de primerreactie slecht zijn.

Opmerking: Het qPCR-systeem kan worden aangepast aan de experimentele behoeften en het fluorescentiefietsermodel.Voor qPCR in een 50μl-systeem, pas de reagensdosering proportioneel aan volgens de 20μl systeem.

2*: Selecteer de juiste eindconcentratie van ROX-referentiekleurstof volgens de fluorescentie-kwantitatieve thermische cycler.De meest geschikte ROX-referentiekleurstofconcentraties voor gewone fluorescentie-kwantitatieve cyclers worden weergegeven in de onderstaande tabel:

Tabel 3-2: qPCR-reactieomstandigheden worden gegeven

Opmerking: om het beste qPCR-effect te verkrijgen, kan gradiënt-PCR worden gebruikt om de reactieomstandigheden voor verschillende sjablonen en verschillende primers te optimaliseren.De PCR-reactieomstandigheden variëren afhankelijk van de fluorescentieanalysator, het sjabloon, de primer, enz. Bij de specifieke bewerking moeten de optimale reactieomstandigheden worden ontworpen volgens de specifieke omstandigheden van de fluorescentie-kwantitatieve thermische cycler, het sjabloontype, de grootte van het betreffende fragment, de basenvolgorde van het geamplificeerde fragment en het GC-gehalte en de lengte van de primers, inclusief annealingstemperatuur, reactietijd, enz.

Ontwerpprincipes voor real-time PCR-primers

Forward Primer en Reverse Primer

Voor real-time PCR is het ontwerp van de primer erg belangrijk.Primers zijn gerelateerd aan de specificiteit en efficiëntie van PCR-amplificatie en kunnen worden ontworpen met verwijzing naar de volgende principes:

◆ Primerlengte: 18-30bp.

◆ GC-inhoud: 40-60%.

◆ Tm-waarde: Primer-ontwerpsoftware, zoals Primer 5, kan de Tm-waarde van de primer geven.De Tm-waarden van de stroomopwaartse en stroomafwaartse primers moeten zo dicht mogelijk bij elkaar liggen.De Tm-berekeningsformule kan ook worden gebruikt: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Bij het uitvoeren van PCR wordt over het algemeen een temperatuur onder de Tm-waarde van de primer van 5 °C gekozen als de annealingstemperatuur (de overeenkomstige verhoging van de annealingstemperatuur kan de specificiteit van de PCR-reactie verhogen).

◆ Primers en PCR-producten:

◆ De lengte van het PCR-amplificatieproduct van de ontwerpprimer is bij voorkeur 100-150 bp.

◆ Ontwerpprimers in het secundaire structurele gebied van de sjabloon moeten zoveel mogelijk worden vermeden.

◆ Vermijd de vorming van 2 of meer complementaire basen tussen de 3'-uiteinden van stroomopwaartse en stroomafwaartse primers.

◆ Primer 3′ eindbasis kan niet aanwezig zijn met 3 extra opeenvolgende G of C.

◆ De primers zelf mogen geen complementaire structuren hebben, anders wordt er een haarspeldstructuur gevormd die de PCR-amplificatie beïnvloedt.

◆ ATCG moet zo gelijkmatig mogelijk in de primersequentie worden verdeeld en de 3'-terminale base moet worden vermeden als T.

Bijlage1：Cell DirectRT-qPCR Kit componentent supplementenpakket

1. Cellysisoplossing