Sterilisatie van pipetpunten en EP-buisjes, enz.
1. Bereid 0,1% (een duizendste) DEPC (zeer giftige stof) met gedeïoniseerd water, gebruik het voorzichtig in een zuurkast en bewaar het bij 4°C uit de buurt van licht;
DEPC-water is zuiver water behandeld met DEPC en gesteriliseerd door hoge temperatuur en hoge druk.Getest om vrij te zijn van RNase, DNase en proteïnase.
2. Plaats de pipetpunt en het EP-buisje in 0,1% DEPC en zorg ervoor dat de pipetpunt en het EP-buisje gevuld zijn met 0,1% DEP.
3. Beschermen tegen licht, laten staan, 's nachts (12-24 uur)
4. De doos met de tip en de EP-buis hoeft niet te worden gedrenkt in DEPC.Nadat u het DEPC-water in de tip of EP-buis ongeveer hebt verwijderd, pakt u het in en wikkelt u het in.
5. 121 graden Celsius, 30min
6. 180 graden Celsius, enkele uren drogen (minstens 3 uur)
Opmerking: een.Draag latexhandschoenen en maskers bij het hanteren van DEPC!b, of zonder DEPC-sterilisatie, 130 ℃, autoclaaf van 90 minuten (veel laboratoria sterilisatie op hoge temperatuur tweemaal)
Overwegingen bij RNA-extractie
Twee belangrijke verschijnselen van falen van weefsel-RNA-isolatie
RNA-afbraak en residuen van onzuiverheden in weefsels,wat afbraak betreft, laten we eerst kijken waarom RNA dat is geëxtraheerd uit gekweekte cellen niet gemakkelijk wordt afgebroken.Bestaande RNA-extractiereagentia bevatten allemaal componenten die RNase snel remmen.Voeg het lysaat toe aan de gekweekte cellen en meng het eenvoudig, alle cellen kunnen grondig worden gemengd met het lysaat en de cellen zijn volledig gelyseerd.Nadat de cellen zijn gelyseerd, remmen de actieve ingrediënten in het lysaat onmiddellijk de intracellulaire RNase, zodat het RNA intact blijft.Dat wil zeggen, omdat de gekweekte cellen gemakkelijk en volledig in contact komen met het lysaat, wordt hun RNA niet gemakkelijk afgebroken;aan de andere kant wordt het RNA in het weefsel gemakkelijk afgebroken omdat de cellen in het weefsel niet gemakkelijk snel in contact kunnen komen met het lysaat.door voldoende contact.Dus,ervan uitgaande dat er een manier is om het weefsel in een enkele cel te veranderen terwijl de RNA-activiteit wordt geremd, zou het probleem van afbraak volledig kunnen worden opgelost.
Vermalen met vloeibare stikstof is de meest effectieve methode.De maalmethode met vloeibare stikstof is echter erg lastig, vooral wanneer het aantal monsters groot is.Dit leidde tot het volgende beste ding: de homogenisator.Dehomogenisatormethode houdt geen rekening met de vraag hoe RNase-activiteit wordt geremd voordat cellen in contact komen met het lysaat, maar bidt eerder dat de snelheid van weefselverstoring sneller is dan de snelheid waarmee intracellulaire RNase RN degradeert.
Het effect van elektrische homogenisator is beter,en het effect van glashomogenisator is slecht, maar in het algemeen kan de homogenisatormethode het degradatiefenomeen niet voorkomen.Daarom, als de extractie is verslechterd, moet de originele elektrische homogenisator worden gebruikt voor het malen met vloeibare stikstof;de originele glashomogenisator moet worden vervangen door een elektrische homogenisator of direct worden gemalen met vloeibare stikstof.Het probleem is bijna 100% haalbaar.opgelost raken.
Het probleem van onzuiverheidsresiduen dat van invloed is op latere experimenten heeft meer verschillende oorzaken dan degradatie, en de oplossingen zijn dienovereenkomstig verschillend.Ten slotte,als er sprake is van degradatie of resterende onzuiverheden in het weefsel, moet de extractiemethode/reagens voor het specifieke experimentele materiaal worden geoptimaliseerd.U hoeft uw kostbare monsters niet te gebruiken voor optimalisatie: u kunt wat kleine dieren zoals vis/kip van de markt kopen, het overeenkomstige deel van het materiaal nemen voor RNA-extractie en het andere deel voor eiwitextractie - vermalen met mond, maag en darmen Extract.
Het doel-RNA van het geëxtraheerde RNA wordt gebruikt voor verschillende vervolgexperimenten en de kwaliteitseisen zijn verschillend
cDNA-bibliotheekconstructie vereist RNA-integriteit zonder residuen van enzymreactieremmers;Northern vereist hogere RNA-integriteit en lagere vereisten voor residuen van enzymreactieremmers;RT-PCR vereist geen te hoge RNA-integriteit,maar remt enzymreacties.Residu-eisen zijn streng.De input bepaalt de output;elke keer dat het doel is om RNA met de hoogste zuiverheid te verkrijgen, kost het de mensen en geld.
Verzameling/opslag van monsters
Factoren die de afbraak beïnvloeden Nadat het monster het levende lichaam/of de oorspronkelijke groeiomgeving heeft verlaten, beginnen de endogene enzymen in het monster RNA af te breken,en de afbraaksnelheid is gerelateerd aan het gehalte aan endogene enzymen en temperatuur.Traditioneel zijn er slechts twee manieren om endogene enzymactiviteit volledig te remmen: lysaat onmiddellijk toevoegen en grondig en snel homogeniseren;in kleine stukjes snijden en onmiddellijk invriezen in vloeibare stikstof.Beide benaderingen vereisen een snelle werking.De laatste is geschikt voor alle monsters, terwijl de eerste alleen geschikt is voor weefsels met een laag gehalte aan cellen en endogene enzymen en gemakkelijker te homogeniseren is.Met name plantenweefsel, lever, thymus, alvleesklier, milt, hersenen, vet, spierweefsel, enz. kunnen het beste worden ingevroren met vloeibare stikstof voordat u verder gaat.
Fragmentatie en homogenisatie van monsters
Factoren die van invloed zijn op afbraak en opbrengst Monsterfragmentatie isvoor grondige homogenisatie, wat is voor volledige en volledige afgifte van RNA.Cellen kunnen direct worden gehomogeniseerd zonder te worden gebroken.Weefsels kunnen pas worden gehomogeniseerd nadat ze zijn gebroken.Gisten en bacteriën moeten worden gebroken met overeenkomstige enzymen voordat ze kunnen worden gehomogeniseerd.Weefsels met een lager endogeen enzymgehalte en gemakkelijker homogeniseren kunnen in één keer in het lysaat worden geplet en gehomogeniseerd door een homogenisator;plantenweefsel, lever, thymus, alvleesklier, milt, hersenen, vet, spierweefsel en andere monsters. Ze bevatten veel endogene enzymen of zijn niet gemakkelijk te homogeniseren.dus weefselverstoring en homogenisatie moeten afzonderlijk worden uitgevoerd.De meest betrouwbare en meest productieve methode van fragmentatie is malen met vloeibare stikstof, en de meest betrouwbare methode van homogenisatie is het gebruik van een elektrische homogenisator.Een speciale opmerking over malen met vloeibare stikstof: het monster mag niet worden ontdooid tijdens het hele maalproces, omdat endogene enzymen waarschijnlijk beter functioneren wanneer ze worden ingevroren.
Keuze van lysaat
Beïnvloeding van het bedieningsgemak en de factoren van resterende endogene onzuiverheden De veelgebruikte lysisoplossingen kunnen de activiteit van RNase bijna remmen.Daarom is het belangrijkste punt bij het kiezen van een lysisoplossing de combinatie met de zuiveringsmethode.Er is één uitzondering:monsters met een hoog gehalte aan endogene enzymen wordt aanbevolen om een lysaat te gebruiken dat fenol bevat om het vermogen om endogene enzymen te inactiveren te vergroten.
Keuze van de zuiveringsmethode
Factoren die resterende endogene onzuiverheden beïnvloeden, extractiesnelheid Voor schone monsters, zoals cellen, kunnen bevredigende resultaten worden verkregen met vrijwel elke beschikbare zuiveringsmethode.Maar voor veel andere monsters, vooral die met een hoog gehalte aan onzuiverheden zoals planten, lever, bacteriën, enz., is het kiezen van een geschikte zuiveringsmethode cruciaal.De kolomcentrifugale zuiveringsmethode heeft een hoge extractiesnelheid en kan effectief onzuiverheden verwijderen die de daaropvolgende enzymatische reactie van RNA beïnvloeden, maar het is duur (Foregene kan kosteneffectieve kits aanbieden, meer details klikhier);het gebruik van economische en klassieke zuiveringsmethoden, zoals LiCl-precipitatie, kan ook bevredigende resultaten opleveren, maar de bedrijfstijd is lang..
"Drie disciplines en acht attenties" voor RNA-extractie
Discipline 1:Maak een einde aan de besmetting van exogene enzymen.
Notitie 1:Draag strikt maskers en handschoenen.
Opmerking 2:De centrifugebuizen, tipkoppen, pipetstaven, elektroforesetanks en experimentele banken die bij het experiment betrokken zijn, moeten grondig worden weggegooid.
Notitie 3:De bij het experiment betrokken reagentia/oplossingen, met name water, moeten RNase-vrij zijn.
Discipline 2:Blokkeer de activiteit van endogene enzymen
Opmerking 4:Kies een geschikte homogenisatiemethode.
Opmerking 5:Kies een geschikt lysaat.
Opmerking 6:Controleer de starthoeveelheid van het monster.
Discipline 3:Verduidelijk uw extractiedoel
Opmerking 7:Met elk lysaatsysteem dat de maximale starthoeveelheid monster nadert, daalt het slagingspercentage van de extractie scherp.
Opmerking 8:Het enige economische criterium voor succesvolle RNA-extractie is een succes in volgende experimenten, niet opbrengst.
Top 10 bronnen van RNase-besmetting
1. Vingers zijn de eerste bron van exogene enzymen, dus handschoenen moeten regelmatig worden gedragen en vervangen.Daarnaast moeten er ook mondkapjes gedragen worden, want ook de ademhaling is een belangrijke bron van enzymen.Een bijkomend voordeel van het dragen van een handschoenmasker is de bescherming van de onderzoeker.
2. Pipetpunten, centrifugebuisjes, pipetten – RNase kan niet worden geïnactiveerd door sterilisatie alleen, daarom moeten pipetpunten en centrifugebuisjes worden behandeld met DEPC, zelfs als ze zijn gemarkeerd als DEPC behandeld.Het is het beste om een speciale pipet te gebruiken, deze voor gebruik af te vegen met een wattenbolletje met 75% alcohol, vooral de staaf;zorg er bovendien voor dat u geen kopverwijderaar gebruikt.
3. Het water/de buffer moet vrij zijn van RNase-verontreiniging.
4. De testtafel moet in ieder geval worden schoongeveegd met wattenbolletjes met 75% alcohol.
5. Endogene RNase Alle weefsels bevatten endogene enzymen, dus het snel invriezen van weefsels met vloeibare stikstof is de beste manier om afbraak te verminderen.De opslag-/maalmethode met vloeibare stikstof is inderdaad onhandig, maar het is de enige manier voor weefsels met hoge niveaus van endogene enzymen.
6. RNA-monsters RNA-extractieproducten kunnen sporen van RNase-besmetting bevatten.
7. Plasmide-extractie Plasmide-extractie gebruikt vaak Rnase om RNA af te breken, en de resterende Rnase moet worden gedigereerd met Proteinase K en geëxtraheerd door PCI.
8. RNA-opslag Zelfs als het bij lage temperatuur wordt bewaard, zullen sporen van RNase RNA-degradatie veroorzaken.De beste oplossing voor het langdurig bewaren van RNA is een zout/alcoholsuspensie, omdat alcohol bij lage temperaturen alle enzymatische activiteit remt.
9. Wanneer kationen (Ca, Mg) deze ionen bevatten, zal RNA bij 80°C gedurende 5 minuten worden gesplitst, dus als RNA moet worden verwarmd, moet de conserveringsoplossing een chelaatvormer bevatten (1 mM natriumcitraat, pH 6,4).
10. Enzymen die in latere experimenten worden gebruikt, kunnen door RNase zijn verontreinigd.
10 tips voor RNA-extractie
1: Voorkom snel RNase-activiteit.Monsters worden na verzameling snel ingevroren en RNase wordt geïnactiveerd door snelle werking tijdens lysis.
2: Kies een geschikte extractiemethode voor weefsel met een hoog ribozymgehalte, en vetweefsel is het beste om de methode met fenol te gebruiken.
3: Voorspellingskwaliteit vereist Northern, cDNA-bibliotheekconstructie vereist hoge integriteit en RT-PCR en RPA (Ribonuclease Protection Assay) vereisen geen hoge integriteit.RT-PCR vereist een hoge zuiverheid (enzymremmerresiduen).
4: Grondige homogenisatie is de sleutel tot het verbeteren van de opbrengst en het verminderen van degradatie.
5: Controleer de integriteit van RNA-elektroforesedetectie, 28S: 18S = 2: 1 is een volledig teken, 1: 1 is ook acceptabel voor de meeste experimenten.
6: Verwijderen van DNA voor RT-PCR, array-analyse Voor het verwijderen van DNA kunt u het beste Dnase I gebruiken.
7: Verminder de verontreiniging van exogene enzymen – enzymen kunnen niet van buitenaf worden geïmporteerd.
8: Bij het concentreren van nucleïnezuur met lage concentratie moet een co-precipitatiereagens worden toegevoegd.Maar om te voorkomen dat de co-precipitant enzymen en DNA-verontreiniging bevat.
9: Los het RNA grondig op, verwarm indien nodig gedurende 5 minuten op 65C.
geschikte opslagmethode
Het kan korte tijd bij -20C worden bewaard en lang bij -80C.De eerste stap bij het verbeteren van de RNA-opbrengst is te beseffen dat het RNA-gehalte van verschillende monsters sterk varieert.Grote hoeveelheden (2-4 ug/mg) zoals lever, alvleesklier, hart, gemiddelde hoeveelheden (0,05-2 ug/mg) zoals hersenen, embryo's, nieren, longen, thymus, eierstokken, lage hoeveelheden (<0,05 ug/mg) mg) zoals blaas, botten, vet.
1: Lyseer cellen om RN vrij te maken – als RNA niet vrijkomt, zal de opbrengst afnemen.Elektrisch homogeniseren werkt beter dan andere homogenisatiemethoden, maar moet mogelijk ook worden gecombineerd met andere methoden, zoals pureren met vloeibare stikstof, enzymatische digestie (Lysozyme/Lyticase)
2: Optimalisatie van de extractiemethode.De grootste problemen met op fenol gebaseerde methoden zijn onvolledige stratificatie en gedeeltelijk RNA-verlies (het supernatant kan niet volledig worden verwijderd).Onvolledige stratificatie is te wijten aan een hoog nucleïnezuur- en eiwitgehalte, wat kan worden opgelost door de hoeveelheid gebruikt lysaat te verhogen of de hoeveelheid monster te verminderen.Een stap van chloroformextractie werd aan het vetweefsel toegevoegd.RNA-verlies kan worden verminderd door terugpompen of door de organische laag te verwijderen gevolgd door centrifugatie.Het grootste probleem met op kolomcentrifugatie gebaseerde methoden is overtollig monster.
Klassieke extractietips
1. Fenolzuivering: voeg een gelijk volume 1:1 fenol/chloroform toe en meng krachtig gedurende 1-2 minuten.Centrifugeer gedurende 2 minuten op hoge snelheid.Verwijder voorzichtig het supernatant (80-90%).Kom nooit bij de middelste laag.Een gelijk volume van de reactieoplossing kan aan fenol/chloroform worden toegevoegd en het supernatant kan worden verwijderd.De twee supernatanten kunnen met elkaar worden gemengd voor precipitatie van nucleïnezuur om de opbrengst te verbeteren.Wees niet te voorzichtig bij het mengen en probeer niet al het supernatant te verwijderen.
2. Wassen met 70-80% ethanol: Tijdens het wassen moet het nucleïnezuur worden gesuspendeerd om ervoor te zorgen dat het achtergebleven zout wordt weggespoeld.Tegelijkertijd, onmiddellijk na het afgieten van de ethanol, een paar seconden op hoge snelheid centrifugeren en vervolgens de resterende ethanol met een pipet verwijderen.Los op na 5-10 minuten staan bij kamertemperatuur.
11. Extractie van speciale organisaties
1. Fibreus weefsel: De sleutel tot RNA-extractie uit fibreus weefsel zoals hart-/skeletspieren is om het weefsel volledig te verstoren.Deze weefsels hebben een lage celdichtheid, dus de hoeveelheid RNA per gewichtseenheid weefsel is laag en het is het beste om een zo groot mogelijke starthoeveelheid te gebruiken.Zorg ervoor dat u het weefsel grondig vermaalt onder vriesomstandigheden.
2. Weefsels met een hoog eiwit-/vetgehalte: het hersen-/plantaardig vetgehalte is hoog.Na PCI-extractie bevat het supernatant witte vlokken.Het supernatant moet opnieuw worden geëxtraheerd met chloroform.
3. Weefsels met een hoog nucleïnezuur-/ribozymgehalte: de milt/thymus heeft een hoog nucleïnezuur- en ribozymgehalte.Het vermalen van weefsel onder vriesomstandigheden gevolgd door snelle homogenisatie kan ribozymen effectief inactiveren.Als het lysaat echter te stroperig is (vanwege het hoge nucleïnezuurgehalte), zal de PCI-extractie niet effectief kunnen stratificeren;het toevoegen van meer lysaat kan dit probleem oplossen.Meerdere PCI-extracties kunnen meer achtergebleven DNA verwijderen.Als zich direct na het toevoegen van alcohol een wit neerslag vormt, duidt dit op DNA-besmetting.Herextractie met zure PCI na oplossing kan DNA-verontreiniging verwijderen.
4. Plantenweefsel: Plantenweefsel is complexer dan dierlijk weefsel.Over het algemeen worden planten gemalen onder omstandigheden van vloeibare stikstof, dus RNA-afbraak door endogene enzymen is ongebruikelijk.Als het degradatieprobleem niet wordt opgelost, wordt het vrijwel zeker veroorzaakt door onzuiverheden in het monster.De onzuiverheden in veel planten zullen leiden tot residuen, en de reden voor residuen is vaak dat deze onzuiverheden overeenkomsten vertonen met RNA: jij slaat neer en ik slaat neer, en jij adsorbeert en ik adsorbeert.Deze kenmerken bepalen dat het zeer sterke enzymremmers zijn.
Op dit moment kunnen commerciële RNA-extractiereagentia met kleine aanpassingen worden aangepast aan bijna alle dierlijke weefsels, maar er zijn weinig commerciële RNA-extractiereagentia die geschikt kunnen zijn voor de meeste plantenweefsels.Gelukkig kan Foregene speciaal biedenRNA-extractiekits voor planten, we hebbenPlant Total RNA-isolatiekit, Plant Total RNA Isolatiekit Plus.Deze laatste is speciaal ontworpen voor planten met een hoog gehalte aan polysacchariden en polyfenolen.Voor RNA-extractie is de feedback van labgebruikers bijzonder goed.
12. Het effect van het invriezen en ontdooien van monsters Het bevroren monster kan groter zijn en moet worden gesneden voordat het wordt gebruikt voor RNA-extractie.Monsters hebben de neiging om (mogelijk gedeeltelijk) te smelten tijdens het snijden.Bevroren monsters moeten mogelijk worden gewogen vóór RNA-extractie, en tijdens dit proces zal zeker ontdooien plaatsvinden.Soms vindt het ontdooien van het monster ook plaats tijdens het malen van vloeibare stikstof;of het bevroren monster wordt direct aan het lysaat toegevoegd zonder vermalen met vloeibare stikstof, en het ontdooien zal zeker plaatsvinden vóór de volledige homogenisatie.Experimenten hebben aangetoond dat ingevroren weefsel gevoeliger is voor RNA-afbraak tijdens het ontdooien dan vers weefsel.De waarschijnlijke reden: het vries-ontdooiproces verstoort structuren in de cel, waardoor endogene enzymen gemakkelijker in direct contact kunnen komen met het RNA.
13. Beoordeling van RNA-kwaliteit Gewoonlijk wordt elektroforese gebruikt om de integriteit van RNA te beoordelen, en A260/A280 wordt gebruikt om de zuiverheid van RNA te beoordelen.In theorie heeft intact RNA een verhouding van 28S:18S = 2,7:1, en de meeste gegevens benadrukken de verhouding van 28S:18S = 2:1.Feit is dat bijna geen van het RNA dat uit andere monsters dan cellen wordt geëxtraheerd, een verhouding van 2:1 heeft (dit werd verkregen met behulp van de Agilent Bioanalyzer).
De elektroforeseresultaten van RNA worden beïnvloed door vele factoren, waaronder secundaire structuur, elektroforeseomstandigheden, monsterbelasting, mate van verzadiging door EB, enz. Gebruik native elektroforese om RNA te detecteren en gebruik DNA Marker als controle.Als de 28S bij 2 kb en de 18S bij 0,9 kb duidelijk zijn, en 28S: 18S > 1, kan de integriteit voldoen aan de vereisten van de meeste volgende experimenten.
A260/A280 is een indicator die voor veel verwarring heeft gezorgd.Allereerst is het nodig om de oorspronkelijke betekenis van deze indicator voor nucleïnezuren te verduidelijken: zuiver RNA, zijn A260/280 = ongeveer 2,0.Zuiver RNA is de 'oorzaak' en A260/A280 = 2 is het 'gevolg'.Nu gebruikt iedereen A260/A280 als 'oorzaak', denkend dat “als A260/A280 = 2, dan is RNA zuiver”, wat natuurlijk tot verwarring leidt.
Als u geïnteresseerd bent, kunt u een beetje reagens dat vaak wordt gebruikt bij extractie, zoals fenol, guanidine-isothiocyanaat, PEG, enz. Aan uw RNA-monster toevoegen en vervolgens de A260/A280-verhouding meten.De realiteit is dat veel van de reagentia die voor RNA-extractie worden gebruikt, evenals veel onzuiverheden in het monster, rond A260 en A280 worden geabsorbeerd, waardoor A260/A280 wordt aangetast.
De meest leerzame benadering op dit moment is het scannen van RNA-monsters in het bereik van 200-300 nm.De curve van puur RNA heeft de volgende kenmerken: de curve is vloeiend, A230 en A260 zijn twee buigpunten, A300 ligt dicht bij 0, A260/A280 = rond 2,0 en A260/A230 = rond 2,0.Als er geen scangegevens beschikbaar zijn, moet ook de verhouding A260/A230 worden bepaald, aangezien deze verhouding gevoeliger is voor overdracht van alle onzuiverheden die de enzymatische reactie beïnvloeden.Houd rekening met het lineaire bereik van het apparaat (0,1–0,5 voor A260).
Er zijn nog twee andere nuttige verschijnselen: de verhouding zal ongeveer 0,3 lager zijn als A260/A280 in water wordt gemeten;terwijl de verhouding gemeten in 10 mM EDTA ongeveer 0,2 hoger is dan die gemeten in 1 mM EDTA.
Gerelateerde producten:
China Plant Total RNA Isolation Kit Fabrikant en leverancier |Foregene (foreivd.com)
RNA-isolatieserie - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Posttijd: 15 juli 2022
