Het is bekend dat in het centrale dogma RNA de transcriptionele bemiddelaar is tussen DNA- en eiwitexpressie.Vergeleken met de detectie van DNA, kan de detectie van RNA objectiever de genexpressie in organismen weerspiegelen.Experimenten met RNA omvatten: qRT-PCR, RNA-Seq en fusiegendetectie, enz. Gebaseerd op de kenmerken van RNA zelf (de suikerring van RNA heeft één vrije hydroxylgroep meer dan de suikerring van DNA), gekoppeld aan een groot aantal RNases in de omgeving, RNA is onstabieler en gemakkelijker af te breken dan DNA.Garbage in, garbage out, als de kwaliteit van RNA niet goed is, dan moeten de experimentele resultaten onbevredigend zijn, met name gemanifesteerd als onnauwkeurige gegevens of slechte herhaalbaarheid.Daarom moet er meer aandacht worden besteed aan de verwerking van RNA en is de koppeling van kwaliteitscontrole ook belangrijker om de precisie en nauwkeurigheid van latere experimentele gegevens te waarborgen.
Voor de kwaliteitscontrole van RNA zijn er over het algemeen de volgende veelgebruikte methoden:
- Spectrofotometrie
- agarosegelelektroforese
- Agilent bioanalyzer
- real-time fluorescerende kwantitatieve PCR
- Qubit fluorescerende kleurstofmethode
01 Spectrofotometrie
RNA heeft dubbele bindingen geconjugeerd en heeft een absorptiepiek bij een golflengte van 260 nm.Volgens de wet van Lambert-Beer kunnen we de RNA-concentratie berekenen uit de absorptiepiek bij 260 nm.Daarnaast kunnen we ook de zuiverheid van RNA berekenen volgens de verhouding van 260nm, 280nm en 230nm absorptiepieken.280 nm en 230 nm zijn respectievelijk de absorptiepieken van eiwitten en kleine moleculen.De verhouding van A260/A280 en A260/A230 van gekwalificeerde RNA-zuiverheid moet groter zijn dan 2. Als het minder dan 2 is, betekent dit dat er eiwit- of kleine molecuulverontreiniging in het RNA-monster is en dat het opnieuw moet worden gezuiverd.Verontreinigingsbronnen zullen downstream-experimenten beïnvloeden, zoals het remmen van de amplificatie-efficiëntie van PCR-reacties, wat resulteert in onnauwkeurige kwantitatieve resultaten.De zuiverheid van RNA heeft een grote invloed op de daaropvolgende resultaten, dus spectrofotometrie is over het algemeen een onmisbare schakel voor kwaliteitscontrole in de eerste stap in nucleïnezuurexperimenten.
Figuur 1. Typisch RNA/DNA-absorptiespectrum
02 Agarose-gelelektroforese
Naast zuiverheid is ook de integriteit van RNA een van de belangrijke indicatoren voor het beoordelen van de kwaliteit van RNA.De afbraak van RNA zal leiden tot een groot aantal korte fragmenten in het monster, zodat het aantal RNA-fragmenten dat effectief kan worden gedetecteerd en gedekt door de referentiesequentie, zal worden verminderd.RNA-integriteit kan worden gecontroleerd door elektroforese van totaal RNA op een 1% agarosegel.Deze methode kan de gel zelf configureren of het geprefabriceerde E-Gel™-systeem gebruiken voor integriteitstesten.Meer dan 80% van het totale RNA is ribosomaal RNA, waarvan het grootste deel bestaat uit 28S- en 18S-rRNA (in zoogdiersystemen).RNA van goede kwaliteit zal twee voor de hand liggende heldere balken tonen, respectievelijk 28S en 18S heldere balken bij 5 Kb en 2 Kb, en de verhouding zal in de buurt van 2:1 liggen.Als het zich in een diffuse toestand bevindt, betekent dit dat het RNA-monster mogelijk is afgebroken en het wordt aanbevolen om de later beschreven methode te gebruiken om de kwaliteit van RNA verder te testen.
Figuur 2. Vergelijking van gedegradeerd (baan 2) en intact RNA (baan 3) op agarosegelelektroforese
03 Agilent Bioanalyzer
Naast de hierboven beschreven agarose-gelelektroforesemethode, die ons kan helpen de integriteit van RNA eenvoudig en snel te identificeren, kunnen we ook de Agilent bioanalyzer gebruiken om de integriteit van RNA te bepalen.Het maakt gebruik van een combinatie van microfluïdica, capillaire elektroforese en fluorescentie om de RNA-concentratie en integriteit te beoordelen.Door het ingebouwde algoritme te gebruiken om het profiel van het RNA-monster te analyseren, kan de Agilent bioanalyzer een referentie-RNA-integriteitswaarde berekenen, RNA Integrity Number (hierna RIN genoemd) [1].Hoe groter de waarde van RIN, hoe hoger de integriteit van het RNA (1 is extreem gedegradeerd, 10 is het meest compleet).Sommige experimenten met RNA suggereren het gebruik van RIN als parameter voor kwaliteitsbeoordeling.Als we sequencing-experimenten met hoge doorvoer (hierna NGS genoemd) als voorbeeld nemen, suggereren de richtlijnen van Oncomine™ Human Immune Repertoire, dat wordt gebruikt voor het detecteren van B-cel- en T-celantigeenreceptoren in de Oncomine-panelserie van Thermo Fisher, dat monsters met RIN-waarden hoger dan 4, effectievere uitlezingen en klonen kunnen worden gemeten (Afbeelding 3).Er zijn verschillende aanbevolen bereiken voor verschillende panels, en vaak kan een hoger RIN effectievere gegevens opleveren.
Afbeelding 3, in Oncomine™ Human Immune Repertoire-experimenten kunnen monsters met een RIN groter dan 4 effectievere metingen en T-celklonen detecteren.【2】
De RIN-waarde heeft echter ook enkele beperkingen.Hoewel RIN een hoge correlatie heeft met de kwaliteit van NGS-experimentele gegevens, is het niet geschikt voor FFPE-monsters.FFPE-monsters zijn lange tijd chemisch behandeld en het geëxtraheerde RNA heeft over het algemeen een relatief lage RIN-waarde.Dit betekent echter niet dat de effectieve gegevens van het experiment onbevredigend moeten zijn.Om de kwaliteit van FFPE-monsters nauwkeurig te kunnen beoordelen, moeten we andere metingen dan RIN gebruiken.Naast RIN kan Agilent bioanalyzer ook de DV200-waarde berekenen als evaluatieparameter van RNA-kwaliteit.DV200 is een parameter die het aandeel fragmenten groter dan 200 bp in een RNA-monster berekent.DV200 is een betere indicator voor de kwaliteit van FFPE-monsters dan RIN.Voor het door FFPE geëxtraheerde RNA heeft het een zeer hoge correlatie met het aantal genen dat effectief kan worden gedetecteerd en de diversiteit van genen [3].Hoewel de DV200 de tekortkomingen in de kwaliteitsdetectie van FFPE kan compenseren, kan de Agilent bioanalyzer de kwaliteitsproblemen in RNA-monsters nog steeds niet volledig analyseren, inclusief of er remmers in de monsters zitten.Remmers zelf kunnen de amplificatie-efficiëntie van stroomafwaartse experimenten beïnvloeden en de hoeveelheid bruikbare gegevens verminderen.Om te weten of er een remmer in het monster zit, kunnen we de hierna beschreven real-time fluorescerende kwantitatieve PCR-methode toepassen.
04 real-time fluorescerende kwantitatieve PCR
De real-time fluorescerende kwantitatieve PCR-methode kan niet alleen de remmers in het monster detecteren, maar ook nauwkeurig de kwaliteit van RNA in het FFPE-monster weergeven.In vergelijking met Agilent biologische analysatoren zijn real-time fluorescentie kwantitatieve instrumenten populairder in grote biologische laboratoria vanwege hun bredere toepassing.Om de kwaliteit van RNA-monsters te testen, hoeven we alleen primerprobes voor interne referentiegenen aan te schaffen of voor te bereiden, zoals GUSB (cat.nr. Hs00939627).Door deze set primers, probes en standaarden (totaal RNA met bekende concentratie) te gebruiken om absolute kwantitatieve experimenten uit te voeren, kan de effectieve RNA-fragmentconcentratie worden berekend als de evaluatiestandaard van RNA-kwaliteit (afgekort Functional RNA Quantitation (FRQ)).In een NGS-test ontdekten we dat de FRQ van RNA-monsters een zeer hoge correlatie heeft met het effectieve datavolume.Voor alle monsters van meer dan 0,2 ng/uL FRQ kan ten minste 70% van de uitlezingen de referentiesequentie effectief dekken (Afbeelding 4).
Figuur 4, de FRQ-waarde gedetecteerd door de fluorescentie-kwantitatieve methode heeft een zeer hoge correlatie (R2>0,9) met de effectieve gegevens verkregen in het NGS-experiment.De rode lijn is de FRQ-waarde gelijk aan 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】
De real-time kwantitatieve PCR-methode is niet alleen toepasbaar op FFPE-monsters, maar kan ook effectief remmers in monsters monitoren.We kunnen het te detecteren monster toevoegen aan het reactiesysteem met interne positieve controle (IPC) en de bijbehorende assay, en vervolgens fluorescentiekwantificering uitvoeren om de Ct-waarde te verkrijgen.Als de Ct-waarde achterblijft bij de Ct-waarde in de reactie zonder monster, geeft dit aan dat de remmer in het monster aanwezig is en remt de amplificatie-efficiëntie in de reactie.
05 Qubit fluorescerende kleurstofmethode
Qubit Fluorometer is het meest gebruikte kleine apparaat voor detectie van nucleïnezuurconcentratie en zuiverheid, dat eenvoudig te bedienen is en in bijna elk laboratorium voor moleculaire biologie voorkomt.Het berekent nauwkeurig de concentratie van nucleïnezuur door detectie en nucleïnezuurbindende fluorescerende kleurstof (Qubit-detectiereagens).Qubit heeft een hoge gevoeligheid en specificiteit en kan RNA nauwkeurig kwantificeren tot een pg/µL-concentratie.Naast het bekende vermogen om de nucleïnezuurconcentratie nauwkeurig te kwantificeren, kan het nieuwste nieuwe model van Thermo Fisher, Qubit 4.0, ook de integriteit van RNA detecteren.Het RNA-detectiesysteem van Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) detecteert de integriteit van RNA door gelijktijdig twee specifieke fluorescerende kleurstoffen te detecteren.Deze twee fluorescerende kleurstoffen kunnen respectievelijk binden aan grote fragmenten en kleine fragmenten van RNA.Deze twee fluorescerende kleurstoffen geven het aandeel van grote RNA-fragmenten in het monster aan, en hieruit kan de IQ-waarde (Integriteit en Kwaliteit) worden berekend die de RNA-kwaliteit vertegenwoordigt.De IQ-waarde is van toepassing op zowel FFPE- als niet-FFPE-monsters en heeft een grote invloed op de kwaliteit van de daaropvolgende sequencing.Als we NGS-experimenten als voorbeeld nemen, in de RNA-Seq-testexperimenten die werden uitgevoerd op het Ion torrent™-platform, hadden de meeste monsters met IQ-waarden hoger dan 4 ten minste 50% effectieve uitlezingen (Afbeelding 5).Vergeleken met de bovengenoemde detectiemethoden is Qubit IQ Assay niet alleen handiger in gebruik en neemt minder tijd in beslag (binnen vijf minuten), maar heeft ook een grote correlatie tussen de gemeten parameter IQ-waarde en de datakwaliteit van downstream-experimenten.
Figuur 5, er is een grote correlatie tussen de Qubit RNA IQ-waarde en de in kaart gebrachte uitlezingen van RNA-Seq.【5】
Door de bovenstaande inleiding denk ik dat iedereen voldoende begrip heeft van verschillende RNA-kwaliteitscontrolemethoden.In de praktijk kun je kiezen
de overeenkomstige methode volgens het steekproeftype en bestaande instrumenten.Alleen door de kwaliteit van RNA goed te controleren, kunnen we het mislukken van latere experimenten als gevolg van een slechte monsterkwaliteit voorkomen, waardoor kostbare tijd, energie en kosten worden bespaard.
Referentieproducten:
referenties
【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.Het RIN: een RNA-integriteitsnummer voor het toekennen van integriteitswaarden aan RNA-metingen.BMC Moleculaire Biol 7, 3 (2006).https:// doi.org/10.1186/1471-21 99-7-3
【2】Oncomine Human Immune Repertoire User Guide (Pub. Nr. MAN0017438 Rev. C.0).
【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formaline-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volume 170, Issue 2, August 2019, Pages 357-373,https://doi.org/10.1093/toxsci/
Posttijd: 12 juni 2023
