RT-qPCR-experiment omvat RNA-extractie en kwaliteitsbeoordeling, reverse transcriptie en qPCR drie stappen, elke stap heeft veel voorzorgsmaatregelen, die we hieronder in detail zullen introduceren.

Ⅰ.RNA-kwaliteitsbeoordeling

In het RT-qPCR-experiment moet na voltooiing van de RNA-extractie de kwaliteit van RNA worden geëvalueerd en kan het vervolgexperiment alleen worden uitgevoerd nadat het is gekwalificeerd.Evaluatiemethoden omvatten spectrofotometer, Agilent-gelelektroforese, Agilent 2100-analyse, waaronder de meest gebruikte spectrofotometer en agarosegel-elektroforesemethode detectie.Opgemerkt moet worden dat deze twee methoden samen moeten worden gebruikt om de detectie en analyse van RNA-concentratie, zuiverheid en integriteit te voltooien, om de kwaliteit van RNA te waarborgen.

Gerelateerde RNA-isolatiekit: 

Cell Total RNA-isolatiekit

Uit verschillende gekweekte cellen kan in 11 minuten zeer gezuiverd totaal-RNA van hoge kwaliteit worden verkregen.

Animal Total RNA-isolatiekit

Extraheer snel en efficiënt totaal RNA van hoge zuiverheid en kwaliteit uit verschillende dierlijke weefsels.

spectrofotometer:

De spectrofotometer wordt voornamelijk gebruikt om de concentratie en zuiverheid van RNA te bepalen, maar kan de integriteit van RNA en genomisch residu niet detecteren.Onder hen zijn A260/280 en A260/230 belangrijke parameters voor detectie van RNA-zuiverheid, en RNA-zuiverheid kan worden gedetecteerd op basis van de fluctuatie van hun waarden:

1. 1.9< A260/280< 2.1, wat aangeeft dat de RNA-zuiverheid goed is;A260/280<1,9, wat aangeeft dat er mogelijk eiwitresidu in RNA zit;A260/280>2.1, wat wijst op mogelijke gedeeltelijke afbraak van RNA, wat verder kan worden bevestigd door agarosegelelektroforese.

2. 2.0< A260/230< 2.2, wat aangeeft dat de RNA-zuiverheid goed is;A260/230< 2.0, wat aangeeft dat er mogelijk residuen van organische reagentia in RNA zitten, zoals fenolen, ethanol of suikers.

Agarosegelelektroforese:

Agarosegelelektroforese-assay kan RNA-integriteit, genoom- en eiwitresiduen analyseren, maar kan de RNA-concentratie niet nauwkeurig kwantificeren of de residuen van organische reagentia detecteren.Neem bijvoorbeeld eukaryotische RNA-templates:

1. Het RNA werd onderworpen aan agarosegelelektroforese.Als er slechts drie enkele banden van 28sRNA, 18sRNA en 5.8sRNA op de gelkaart waren, geeft dit aan dat het geëxtraheerde RNA intact is.Als er een slepend fenomeen is, duidt dit op een gedeeltelijke afbraak van RNA.

2. Als er een enkele heldere band is tussen het lijmgat en de 28sRNA-band, kan er genomisch DNA-residu zijn.

3. Als er banden in het lijmgat verschijnen, geeft dit aan dat er mogelijk resten van eiwitten en andere macromoleculaire stoffen zijn.

Ⅱ. Omgekeerde transcriptie

Nadat de RNA-extractie is voltooid, moet het worden omgezet in cDNA voor volgende experimenten, dus de omkeerstap is essentieel.Reverse transcriptie zal worden geïntroduceerd vanuit de selectie van reverse transcriptase en primer:

Reverse transcriptase-selectie:

De typische reverse transcriptases omvatten AMV RTase en MMLV RTase.De RNase H van AMV RTase heeft een sterke activiteit, korte syntheselengte, lage synthesehoeveelheid en goede thermische stabiliteit (42 ~ 55℃).De RNase H-activiteit van MMLV RTase is zwak, de syntheselengte is lang, de synthesehoeveelheid is hoog en de thermische stabiliteit is slecht (37 ~ 42 ℃).

Omdat RNase H-enzym de functie heeft van het afbreken van RNA-template, moet MMLV met zwakke RNase H-activiteit bij voorkeur worden geselecteerd tijdens reverse transcriptie, en na latere genetische manipulatie heeft de thermische stabiliteit van MMLV een kwalitatieve sprong voorwaarts gemaakt.Foregene nemenForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV voor reverse transcriptie) het is bijvoorbeeld een nieuwe reverse transcriptase die tot expressie wordt gebracht in door E. coli gemanipuleerde bacteriën met behulp van genetische recombinatietechnologie.Het is een recombinant DNA-polymerase dat een complementaire DNA-streng synthetiseert uit enkelstrengs RNA, DNA of een RNA:DNA-hybride.Het heeft geen RNase H-activiteit, sterke stabiliteit, sterke RNA-affiniteit en hoge detectiegevoeligheid.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV voor reverse transcriptie)

Selectie van primer:

Over het algemeen vallen RT-primers in drie categorieën: oligo-dT, willekeurige primers en genspecifieke primers.Selecteer geschikte primers voor gebruik volgens verschillende experimentele vereisten.

1. Als de template van eukaryote oorsprong is en het late cDNA wordt gebruikt voor routinematige PCR-amplificatie, wordt Oligo (dT) aanbevolen;Als het daaropvolgende experiment alleen wordt gebruikt voor qPCR, wordt aanbevolen Oligo (dT) te mengen met willekeurige primers om de efficiëntie van reverse transcriptie te verbeteren.

2. Als de template afkomstig is van prokaryoten, moeten willekeurige primers of genspecifieke primers worden geselecteerd voor reverse transcriptie.

Ⅲ.qPCR

Fluorescentiekwantificering wordt voornamelijk uitgewerkt op basis van de selectie van kwantitatieve methoden, primerontwerpprincipes, ROX-selectie, reactiesysteemconfiguratie en instelling van reactieomstandigheden, enz.

Selectie van kwantitatieve methoden:

Kwantitatieve methoden zijn onderverdeeld in relatieve kwantitatieve methoden en absolute kwantitatieve methoden.Relatieve kwantificering kan worden gebruikt om het effect van bepaalde behandelingsmethoden op genexpressie te detecteren, het verschil in genexpressie op verschillende tijdstippen te detecteren en het verschil in genexpressie in verschillende weefsels te vergelijken.Absolute kwantificering kan de hoeveelheid nucleïnezuur in het virus detecteren, enzovoort.Bij het doen van experimenten moeten we de juiste kwantitatieve methoden kiezen op basis van onze eigen experimenten.

Primer-ontwerpprincipes:

Het ontwerp van de primer voor qPCR is direct gerelateerd aan de amplificatie-efficiëntie en productspecificiteit.Daarom is het correct ontwerpen van goede primers de eerste stap van succesvolle qPCR.Bij het ontwerp van primer moet op de volgende principes worden gelet om te voldoen aan het principe van conventioneel primerontwerp:

1. De lengte van het doelfragment wordt geregeld tussen 100 en 300 bp;

2. Cross-exon-ontwerp om de invloed van genomisch DNA te vermijden;

3. De ontworpen primers moeten worden getest op amplificatie-efficiëntie en alleen wanneer de amplificatie-efficiëntie de norm bereikt (90-110%) kunnen ze worden gebruikt voor kwantitatieve experimenten;

4. Primerconcentratie wordt meestal geoptimaliseerd tussen 0,1 uM en 1,0 uM.

Selectie vanROX:

Tijdens het kwantitatieve reactieproces kan ROX het optische padverschil, de pipetteerfout of het volumeverschil veroorzaakt door verdamping en condensatie gelijkmatig aanpassen, waardoor de herhaalbaarheid van de resultaten wordt verbeterd.Er moet echter worden opgemerkt dat de selectie van ROX gerelateerd is aan het instrument.Als het qPCR-instrument de functie heeft om automatisch het verschil tussen gaten te corrigeren, hoeft het geen ROX toe te voegen;anders moet het ROX-correctie toevoegen.Kleine partners bij het kopen van reagentia moeten volgens het gebruikte instrument de juiste ROX kiezen, om latere fouten te voorkomen.

Voorbereiding van het reactiesysteem:

Reactievolumes van 20 µl en 50 µl hebben de voorkeur.Bij het opstellen van het systeem dient op de volgende zaken gelet te worden:

1. Het reactiesysteem moet worden voorbereid door ventilatie in de ultraschone werkbank, nieuwe ddH₂O wordt voor elk experiment gebruikt;

2. Elk experiment moet NTC voorbereiden om te verifiëren of er vervuiling in het systeem is, en elk paar primers moet NTC doen bij het voorbereiden van het systeem;

3. Om te detecteren of er gDNA-residu in de RNA-template zit, kan voor elk monster NRT worden voorbereid voor detectie;

4. Bij het voorbereiden van het systeem wordt aanbevolen om ten minste 3 technische herhalingen uit te voeren voor één monster;

5. Wanneer de sjabloon cDNA is, wordt aanbevolen om 5-10 keer te verdunnen om het remmende effect van het omgekeerde transcriptiesysteem op het qPCR-experiment te verminderen.Het is beter om de sjabloonhoeveelheid per gradiënt te onderzoeken, zodat de CT-waarde tussen 20-30 valt;

6. Bepaal het vereiste aantal reacties, verhoog met 5-10% op basis van het aantal reacties en bereken het volumeconfiguratienummer;

7, het systeem wordt bereid met behulp van het premix-principe, mengen na centrifugeren en ervoor zorgen dat er geen luchtbellen ontstaan;

8, voor zover mogelijk om ondersteunende verbruiksartikelen te kiezen.

Gerelateerde RT-qPCR-kit