RT-qPCR is ontwikkeld op basis van gewone PCR-technologie.Het voegt fluorescerende chemicaliën (fluorescerende kleurstoffen of fluorescerende sondes) toe aan het traditionele PCR-reactiesysteem en detecteert het PCR-gloei- en verlengingsproces in realtime volgens hun verschillende luminescerende mechanismen.Fluorescerende signaalveranderingen in het medium worden gebruikt om de hoeveelheid productverandering in elke PCR-cyclus te berekenen.Momenteel zijn de meest gebruikelijke methoden de fluorescerende kleurstofmethode en de sondemethode.

Fluorescerende verfmethode:
Sommige fluorescerende kleurstoffen, zoals SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, enz., zenden zelf geen licht uit, maar zenden fluorescentie uit na binding aan de kleine groef van dsDNA.Daarom kan de machine aan het begin van de PCR-reactie het fluorescerende signaal niet detecteren.Wanneer de reactie doorgaat naar de annealing-extensie (tweestapsmethode) of verlengingsfase (driestapsmethode), worden de dubbele strengen op dit moment geopend en de nieuwe DNA-polymerase.Naarmate het aantal PCR-cycli toeneemt, combineren steeds meer kleurstoffen met dsDNA en wordt het fluorescentiesignaal ook continu verbeterd.Neem SYBR Groen Ⅰ als voorbeeld.
sonde methode:
De Taqman-sonde is de meest gebruikte hydrolyse-sonde.Er is een fluorescerende groep aan het 5'-uiteinde van de sonde, meestal FAM.De probe zelf is een sequentie die complementair is aan het doelgen.Er is een fluorescerende dovende groep aan het 3'-uiteinde van de fluorofoor.Volgens het principe van fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (Förster-resonantie-energieoverdracht, FRET), wanneer de reporter-fluorescerende groep (donor-fluorescerende molecule) en de dovende fluorescerende groep (acceptor-fluorescerende molecule) het excitatiespectrum overlapt en de afstand zeer dichtbij is (7-10nm), kan de excitatie van het donormolecuul de fluorescentie van het acceptormolecuul induceren, terwijl de autofluorescentie verzwakt is.Daarom zal aan het begin van de PCR-reactie, wanneer de sonde vrij en intact is in het systeem, de fluorescerende reportergroep geen fluorescentie uitzenden.Bij het uitgloeien binden de primer en de sonde aan de sjabloon.Tijdens de uitbreidingsfase synthetiseert het polymerase continu nieuwe ketens.DNA-polymerase heeft 5'-3'-exonuclease-activiteit.Bij het bereiken van de sonde zal de DNA-polymerase de sonde hydrolyseren van de sjabloon, de reporter-fluorescentiegroep scheiden van de quencher-fluorescentiegroep en het fluorescentiesignaal vrijgeven.Aangezien er een één-op-één-relatie is tussen de sonde en de sjabloon, is de sondemethode superieur aan de kleurstofmethode wat betreft de nauwkeurigheid en gevoeligheid van de test.

Afb. 1 Principe van qRT-PCR

Primer-ontwerp
Principes:

De primers moeten worden ontworpen in het geconserveerde gebied van de nucleïnezuurreeks en moeten specificiteit hebben.

Het is het beste om cDNA-sequentie te gebruiken, en mRNA-sequentie is ook acceptabel.Zo niet, ontdek dan het cds-regio-ontwerp van de DNA-sequentie.
De lengte van het fluorescerende kwantitatieve product is 80-150 bp, de langste is 300 bp, de primerlengte ligt over het algemeen tussen 17-25 basen en het verschil tussen de stroomopwaartse en stroomafwaartse primers mag niet te groot zijn.

Het G+C-gehalte ligt tussen de 40% en 60% en 45-55% is het beste.
De TM-waarde ligt tussen de 58-62 graden.
Probeer primerdimeren en zelfdimeren te vermijden (verschijnen niet meer dan 4 paar opeenvolgende complementaire basen) haarspeldstructuur, indien onvermijdelijk, maak ΔG<4,5 kJ/mol* Als u er niet zeker van kunt zijn dat gDNA is verwijderd tijdens reverse transcriptie Reinig, kunt u het beste de primers van het intron ontwerpen *3'-uiteinde kan niet worden gewijzigd, en om AT-, GC-rijke gebieden te vermijden, vermijdt u T/C, A/G-primers met continue structuur (2-3) en niet-
specifiek De homologie van de heterogeen geamplificeerde sequentie is bij voorkeur minder dan 70% of heeft 8 complementaire basenhomologie.
Gegevensbestand:
CottonFGD zoeken op trefwoorden
Primer-ontwerp:
IDT-qPCR-primerontwerp

Fig2 IDT online primer design tool pagina

Weergave van de resultatenpagina van Fig3
Ontwerp van lncRNA-primers:
lncRNA:dezelfde stappen als mRNA.
miRNA:Het principe van de stem-loop-methode: aangezien alle miRNA's korte sequenties van ongeveer 23 nt zijn, kan directe PCR-detectie niet worden uitgevoerd, dus wordt de stem-loop-sequentietool gebruikt.De stam-lus-sequentie is een enkelstrengs DNA van ongeveer 50 nt, dat op zichzelf een haarspeldstructuur kan vormen.3 'Het uiteinde kan worden ontworpen als een sequentie die complementair is aan het gedeeltelijke miRNA-fragment, vervolgens kan het doelwit-miRNA worden verbonden met de stam-lussequentie tijdens reverse transcriptie en kan de totale lengte 70 bp bereiken, wat in overeenstemming is met de lengte van het geamplificeerde product bepaald door qPCR.Tailing miRNA-primerontwerp.
Versterkingspecifieke detectie:
Online ontploffingsdatabase: CottonFGD ontploffing door sequentieovereenkomst
Lokale explosie: Verwijs naar het gebruik van Blast + om lokale explosie uit te voeren, linux en macos kunnen direct een lokale database opzetten, win10-systeem kan ook worden gedaan na het installeren van ubuntu bash.Maak een lokale ontploffingsdatabase en lokale ontploffing;open ubuntu bash op win10.
Let op: Hooglandkatoen en zee-eilandkatoen zijn tetraploïde gewassen, dus het resultaat van ontploffing zal vaak twee of meer lucifers zijn.In het verleden zal het gebruik van NAU-cd's als een database om blast uit te voeren waarschijnlijk twee homologe genen vinden met slechts een paar SNP-verschillen.Gewoonlijk kunnen de twee homologe genen niet worden gescheiden door primerontwerp, dus worden ze als hetzelfde behandeld.Als er een voor de hand liggende indel is, wordt de primer meestal op de indel ontworpen, maar dit kan leiden tot de secundaire structuur van de primer. De vrije energie wordt hoger, wat leidt tot een afname van de versterkingsefficiëntie, maar dit is onvermijdelijk.

Detectie van secundaire structuur van de primer:
Stappen:open oligo 7 → invoer sjabloonreeks → sluit subvenster → opslaan → zoek primer op sjabloon, druk op ctrl+D om primerlengte in te stellen → analyseer verschillende secundaire structuren, zoals zelfdimerisatielichaam, heterodimeer, haarspeld, mismatch, etc. De laatste twee afbeeldingen in figuur 4 zijn de testresultaten van de primers.Het resultaat van de voorste primer is goed, er is geen duidelijke dimeer- en haarspeldstructuur, geen continue complementaire basen, en de absolute waarde van vrije energie is minder dan 4,5, terwijl de achterste primer continu toont. De 6 basen zijn complementair en de vrije energie is 8,8;bovendien verschijnt een serieuzer dimeer aan het 3'-uiteinde en verschijnt een dimeer van 4 opeenvolgende basen.Hoewel de vrije energie niet hoog is, kan de 3'-dimeer Chl de amplificatiespecificiteit en de amplificatie-efficiëntie ernstig beïnvloeden.Daarnaast is het noodzakelijk om te controleren op haarspeldbochten, heterodimeren en mismatches.

Fig3 oligo7 detectieresultaten
Detectie van versterkingsefficiëntie:
De amplificatie-efficiëntie van de PCR-reactie heeft een ernstige invloed op de PCR-resultaten.Ook bij qRT-PCR is vooral de amplificatie-efficiëntie belangrijk voor de kwantitatieve resultaten.Verwijder andere stoffen, machines en protocollen in de reactiebuffer.De kwaliteit van de primers heeft ook een grote invloed op de amplificatie-efficiëntie van qRT-PCR.Om de nauwkeurigheid van de resultaten te garanderen, moeten zowel de relatieve fluorescentiekwantificering als de absolute fluorescentiekwantificering de amplificatie-efficiëntie van de primers detecteren.Erkend wordt dat de effectieve qRT-PCR-amplificatie-efficiëntie tussen 85% en 115% ligt.Er zijn twee methoden:
1. Standaardcurvemethode:
A.Meng cDNA
B.Gradiënt verdunning
c.qPCR
D.Lineaire regressievergelijking om de versterkingsefficiëntie te berekenen
2. LinRegPCR
LinRegPCR is een programma voor de analyse van realtime RT-PCR-gegevens, ook wel kwantitatieve PCR-gegevens (qPCR) genoemd op basis van SYBR Green of vergelijkbare chemie.Het programma gebruikt niet-basislijngecorrigeerde gegevens, voert een basislijncorrectie uit op elk monster afzonderlijk, bepaalt een lineairiteitsvenster en gebruikt vervolgens lineaire regressieanalyse om een ​​rechte lijn door de PCR-gegevensset te passen.Uit de helling van deze lijn wordt de PCR-efficiëntie van elk afzonderlijk monster berekend.De gemiddelde PCR-efficiëntie per amplicon en de Ct-waarde per monster worden gebruikt om een ​​startconcentratie per monster te berekenen, uitgedrukt in willekeurige fluorescentie-eenheden.Gegevensinvoer en -uitvoer vinden plaats via een Excel-spreadsheet.Alleen monster
mengen is vereist, geen gradiënt
stappen zijn vereist:(Neem Bole CFX96 als voorbeeld, niet helemaal Machine met duidelijke ABI)
experiment:het is een standaard qPCR-experiment.
qPCR-gegevensuitvoer:LinRegPCR kan twee soorten uitvoerbestanden herkennen: RDML of kwantificering Amplificatieresultaat.In feite is het de real-time detectiewaarde van het cyclusnummer en het fluorescentiesignaal door de machine, en de versterking wordt verkregen door de fluorescentieveranderingswaarde van de lineaire segmentefficiëntie te analyseren.
Gegevens selectie: In theorie zou de RDML-waarde bruikbaar moeten zijn.Naar schatting is het probleem van mijn computer dat de software RDML niet kan herkennen, dus ik heb de Excel-uitvoerwaarde als de originele gegevens.Het wordt aanbevolen om eerst een ruwe screening van de gegevens uit te voeren, zoals het mislukken van het toevoegen van monsters, enz. De punten kunnen worden verwijderd in de uitvoergegevens (u kunt ze natuurlijk niet verwijderen, LinRegPCR zal deze punten in een later stadium negeren)

Fig5 export van qPCR-gegevens

Fig6 selectie van kandidaatmonsters

Gegevensinvoer:Open kwalificatieamplificatie results.xls, → open LinRegPCR → bestand → lees uit Excel → selecteer parameters zoals weergegeven in figuur 7 → OK → klik op baselines bepalen

Fig7 stappen van linRegPCR gegevensinvoer

Resultaat:Als er geen herhaling is, is groeperen niet nodig.Als er herhaling is, kan de groepering worden bewerkt in de voorbeeldgroepering en wordt de naam van het gen ingevoerd in de identifier, waarna hetzelfde gen automatisch wordt gegroepeerd.Klik ten slotte op het bestand, exporteer Excel en bekijk de resultaten.De amplificatie-efficiëntie en R2-resultaten van elk putje worden weergegeven.Ten tweede, als u in groepen verdeelt, wordt de gecorrigeerde gemiddelde versterkingsefficiëntie weergegeven.Zorg ervoor dat de amplificatie-efficiëntie van elke primer tussen 85% en 115% ligt.Als het te groot of te klein is, betekent dit dat de amplificatie-efficiëntie van de primer slecht is.

Afb. 8 Resultaat en gegevensuitvoer

Experimenteel proces:
RNA-kwaliteitseisen:
Puurheid:1.72.0 geeft aan dat er mogelijk isothiocyanaatresten aanwezig zijn.Schoon nucleïnezuur A260/A230 zou ongeveer 2 moeten zijn. Als er een sterke absorptie is bij 230 nm, geeft dit aan dat er organische verbindingen zijn zoals fenaationen.Bovendien kan het worden gedetecteerd door 1,5% agarosegelelektroforese.Richt de marker, omdat het ssRNA geen denaturatie heeft en de logaritme van het molecuulgewicht geen lineaire relatie heeft en het molecuulgewicht niet correct kan worden uitgedrukt.Concentratie: Theoretischnietminder dan 100ng / ul, als de concentratie te laag is, is de zuiverheid over het algemeen laag, niet hoog

Fig9 RNA-gel

Bovendien, als het monster kostbaar is en de RNA-concentratie hoog is, wordt aanbevolen om het na extractie in porties te verdelen en het RNA te verdunnen tot een eindconcentratie van 100-300 ng/ul voor reverse transcriptie.Inhet proces van reverse transcriptie, wanneer mRNA wordt getranscribeerd, worden oligo (dt) primers die specifiek kunnen binden aan polyA-staarten gebruikt voor reverse transcriptie, terwijl lncRNA en circRNA willekeurige hexamere (Random 6 mer) primers gebruiken voor reverse transcriptie van totaal RNA. Voor miRNA worden miRNA-specifieke neklusprimers gebruikt voor reverse transcriptie.Veel bedrijven hebben inmiddels speciale staartkits op de markt gebracht.Voor de stem-loop-methode is de tailing-methode handiger, met een hoge doorvoer en reagensbesparend, maar het effect van het onderscheiden van miRNA's van dezelfde familie zou niet zo goed moeten zijn als de stem-loop-methode.Elke reverse transcriptiekit heeft vereisten voor de concentratie van genspecifieke primers (stem-loops).De interne referentie die wordt gebruikt voor miRNA is U6.Tijdens het inversieproces van de stamlus moet een buis van U6 afzonderlijk worden omgekeerd en moeten de voor- en achterprimers van U6 direct worden toegevoegd.Zowel circRNA als lncRNA kunnen HKG's als interne referentie gebruiken.IncDNA-detectie,
als er geen probleem is met RNA, zou cDNA ook in orde moeten zijn.Als echter de perfectie van het experiment wordt nagestreefd, kan het beste een intern referentiegen (referentiegen, RG) worden gebruikt dat gDNA van cd's kan onderscheiden.Over het algemeen is RG een huishoudelijk gen., HKG) zoals weergegeven in figuur 10;In die tijd maakte ik opslageiwitten van sojabonen en gebruikte ik actine7-bevattende introns als interne referentie.De grootte van het geamplificeerde fragment van deze primer in gDNA was 452 bp, en als cDNA als matrijs werd gebruikt, was het 142 bp.Toen bleek uit de testresultaten dat een deel van het cDNA daadwerkelijk was besmet met gDNA, en het bewees ook dat er geen probleem was met het resultaat van reverse transcriptie, en het kon worden gebruikt als een sjabloon voor PCR.Het heeft geen zin om agarosegelelektroforese rechtstreeks met cDNA uit te voeren, en het is een diffuse band, wat niet overtuigend is.

Fig 10 cDNA-detectie

De bepaling van qPCR-conditiesis over het algemeen geen probleem volgens het protocol van de kit, voornamelijk in de stap van de tm-waarde.Als sommige primers niet goed zijn ontworpen tijdens het primerontwerp, wat resulteert in een groot verschil tussen de tm-waarde en de theoretische 60°C, wordt aanbevolen dat het cDNA, nadat de monsters zijn gemengd, een gradiënt-PCR met primers uitvoert en probeert te voorkomen dat de temperatuur zonder banden als de TM-waarde wordt ingesteld.

Gegevens analyse

De conventionele relatieve fluorescentie kwantitatieve PCR-verwerkingsmethode is in principe volgens 2-ΔΔCT.Sjabloon voor gegevensverwerking.

Gerelateerde producten:

Realtime PCR Eenvoudig^TM –Taqman

Realtime PCR Eenvoudig^TM –SYBR GROEN I

RT Easy I (Master Premix voor eerste streng cDNA-synthese)

RT Easy II (Master Premix voor eerste streng cDNA-synthese voor qPCR)