Specificiteit van detectie
In de meeste gevallen is het doel van primerontwerp het maximaliseren van de specificiteit van PCR.Dit wordt bepaald door de min of meer voorspelbare invloed van vele variabelen.Een belangrijke variabele is de sequentie aan het 3'-uiteinde van de primer.
Belangrijk is dat PCR-assays die zijn ontworpen voor specificiteit waarschijnlijker een hoge efficiëntie behouden over een breed dynamisch bereik, omdat de assay geen niet-specifieke amplificatieproducten produceert, waardoor ze concurreren met PCR-reagentia of de belangrijkste amplificatiereactie remmen.
In sommige gevallen is specificiteit natuurlijk niet het belangrijkste, bijvoorbeeld wanneer het doel is om nauw verwante maar verschillende pathogenen te kwantificeren, zijn speciale ontwerp-, optimalisatie- en verificatienormen vereist.
De smeltkromme is een standaardmethode voor het beoordelen van de specificiteit van amplicons, althans wat betreft het al dan niet versterken van een enkel doel.Er moet echter worden benadrukt dat de smeltkrommen misleidend kunnen zijn, omdat ze bijvoorbeeld kunnen worden beïnvloed door de gecombineerde effecten van suboptimale primers en lage matrijsconcentraties.
P5 |De smeltkromme toont de Tm-verschuivingen verkregen uit twee detecties van verschillende hoeveelheden van twee doel-DNA's.
A. Bij hogere concentraties (ad)) is er geen duidelijk primerdimeer nadat de qPCR-meting is voltooid.Naarmate de matrijsconcentratie afneemt tot 50 kopieën (e), begint een niet-specifiek product te verschijnen en wordt dit het enige product met de laagste concentratie (f).
B. De test registreerde dezelfde Tms bij alle doelconcentraties en er was geen duidelijk primerdimeer, zelfs niet bij de laagste concentratie (5 kopieën).Bij gebruik van deze twee detectiemethoden werden geen amplificatieproducten gedetecteerd in NTC's.
P5 toont de oploskrommen die zijn verkregen met monsters waarin de matrijs in verschillende concentraties aanwezig is.P 5a laat zien dat bij de twee laagste concentraties de Tms van de geproduceerde niet-specifieke amplificatieproducten lager zijn dan die van de specifieke amplicons.
Het is duidelijk dat deze detectiemethode niet betrouwbaar kan worden gebruikt om doelen te detecteren die in lage concentraties voorkomen.
Interessant is dat NTC's, dwz monsters zonder helemaal geen DNA, geen (niet-specifieke) amplificatieproducten registreerden, wat aangeeft dat genomisch achtergrond-DNA kan deelnemen aan niet-specifieke amplificatie/polymerisatie.
Soms kunnen dergelijke achtergrondprimers en niet-specifieke amplificatie niet worden verholpen, maar het is vaak mogelijk om een detectiemethode te ontwerpen die geen niet-specifieke amplificatie heeft in welke matrijsconcentratie en NTC dan ook (P 5b).
Hier zal zelfs het opnemen van de amplificatie van de doelconcentratie met een Cq van 35 een specifieke ontbindingscurve opleveren.Evenzo vertoonden NTC's geen tekenen van niet-specifieke amplificatie.Soms is het detectiegedrag afhankelijk van de moederloog en wordt alleen niet-specifieke amplificatie gedetecteerd in bepaalde buffersamenstellingen, die verband kunnen houden met verschillende Mg2+-concentraties.
Stabiliteit van detectie
De optimalisatie van Ta is een nuttige stap in het empirische verificatie- en optimalisatieproces van qPCR-detectie.Het geeft een directe indicatie van de robuustheid van de primerset door de temperatuur (of temperatuurbereik) weer te geven die de laagste Cq produceert zonder de NTC te versterken.
Het twee- tot viervoudige verschil in gevoeligheid is misschien niet belangrijk voor mensen met een hoge mRNA-expressie, maar voor diagnostische tests kan het het verschil betekenen tussen positieve en fout-negatieve resultaten.
De Ta-eigenschappen van qPCR-primers kunnen sterk variëren.Sommige tests zijn niet erg robuust en als ze niet worden uitgevoerd onder de optimale Ta-waarde van de primers, zullen ze snel instorten.
Dit is belangrijk omdat dit type detectie in de echte wereld vaak problematisch is en de zuiverheid van het monster, de concentratie van DNA of de aanwezigheid van ander DNA mogelijk niet optimaal is.
Bovendien kan het doelkopienummer binnen een breed bereik variëren en kunnen de reagentia, plastic gebruiksvoorwerpen of instrumenten verschillen van degene die werden gebruikt bij het opzetten van de test.
P6|De temperatuurgradiënt toont de verschillende robuustheid van PCR-detectie.
A. Gebruik Bioline's Sensifast SYBR mastermix (catalogusnummer BIO-98050) om PCR uit te voeren op cDNA bereid uit menselijk hersen-RNA.
B. Gebruik het CFX qPCR-instrument van Bio-Rad om de amplificatiekaart en de oplossingscurve van apaleen vast te leggen (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Amplificatiegrafiek en smeltkromme van ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Amplificatiegrafiek en ontbindingscurve van GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTGTGGATCTTC).
E. Cqs opgenomen bij verschillende gloeitemperaturen, die het verschil in Cq laten zien onder een temperatuurgradiënt van 7°C.
P 6 toont een typisch resultaat van een ongewenste test, waarbij qPCR werd uitgevoerd met behulp van een gradiënt Tas tussen 59C en 67C (P 6a), met behulp van primers voor drie menselijke hersenspecifieke genen.
Uit de amplificatiegrafiek blijkt dat Opalin-primers verre van ideaal zijn omdat hun optimale Ta-bereik erg smal is (Figuur 6b), dat wil zeggen dat Cq's wijd verspreid zijn, waardoor Cq's aanzienlijk worden vergeleken met hun optimale Cqs Low.
Deze detectiemethode is onstabiel en kan leiden tot suboptimale versterking.Daarom moet dit paar primers opnieuw worden ontworpen.Bovendien blijkt uit de smeltkromme-analyse (inzet) dat de specificiteit van deze detectiemethode ook problematisch kan zijn, omdat de smeltkromme van elke Ta verschillend is.
De ACSBG1-detectiemethode die wordt weergegeven in P 6c is robuuster dan de bovenstaande Opalin-detectiemethode, maar is nog verre van ideaal en kan waarschijnlijk worden verbeterd.
We benadrukken echter dat er geen noodzakelijk verband bestaat tussen robuustheid en specificiteit, omdat de oploscurve geproduceerd door deze detectiemethode dezelfde piekwaarde laat zien in alle Tas (inzet).
Aan de andere kant is de robuustheidstest veel toleranter en produceert vergelijkbare Cq's in een breed bereik van Tas, zoals in de GFAP-test getoond in P 6d.
Het verschil in Cqs verkregen in hetzelfde bereik van 8 graden Celsius is minder dan 1, en de ontbindingscurve (inzet) bevestigt de detectiekarakteristieken in dit temperatuurbereik.Het is vermeldenswaard dat de berekende Tas en het werkelijke Ta-bereik heel verschillend kunnen zijn.
Er zijn veel richtlijnen ontworpen om onderzoekers te helpen bij het ontwerpen van efficiënte primers, waarvan de meeste gebaseerd zijn op reeds lang bestaande regels en er is veel aandacht besteed aan het 3'-uiteinde van de primers.Het wordt vaak aanbevolen om een G of C aan het 3'-uiteinde en twee G- of C-bases (GC-klem) op te nemen, maar niet meer dan twee van de laatste 5 basen.
In de praktijk kunnen deze regels onderzoekers richting geven, maar ze zijn niet noodzakelijkerwijs onder alle omstandigheden correct.
P7 |Het 3'-uiteinde van de primer heeft weinig effect op specificiteit of efficiëntie.
A. De positie van de primers voor het humane HIF-1α (NM_181054.2) gen.
B. Gebruik Agilent Brilliant III SYBR Groene moederloog (Cat. Nr. 600882) om zes testitems te versterken.
C. Amplificatiegrafiek en smeltkromme opgenomen door Bio-Rad's CFX qPCR-instrument en 3'end primers.NTC's worden in rood weergegeven.
D. Cqs-record van elk testonderdeel
Het resultaat in P 7 is bijvoorbeeld in tegenspraak met de 3'-eindregel.Alle ontwerpen produceren in wezen dezelfde resultaten, met slechts twee primercombinaties die leiden tot niet-specifieke amplificatie in NTC.
We kunnen het effect van de GC-clip echter niet ondersteunen, omdat in dit geval het gebruik van A of T als maximaal 30 basen de specificiteit niet vermindert.
Test C, waarbij de F-primer eindigt in GGCC, registreerde wel Cq's in NTC's, wat aangeeft dat men deze sequenties aan het 30-uiteinde misschien zou willen vermijden.We benadrukken dat de enige manier om de beste 3'-eindsequentie van een primerpaar te bepalen, is om enkele kandidaat-primers experimenteel te evalueren.
Versterkingsefficiëntie
Belangrijk is dat hoewel niet-specifieke PCR-detectie nooit specifiek kan worden, de amplificatie-efficiëntie op veel verschillende manieren kan worden aangepast en gemaximaliseerd door het enzym, de moederloog, additieven en cyclusomstandigheden te veranderen.
Om de efficiëntie van PCR-detectie te evalueren, is het het beste om een seriële verdunning van 10 of 5 keer het doelnucleïnezuur te gebruiken, dat wil zeggen de "standaardcurvemethode".
Als PCR-amplicons of synthetische DNA-targets worden gebruikt om een standaardcurve te genereren, moeten seriële verdunningen van deze targets worden gemengd met een constante hoeveelheid achtergrond-DNA (zoals genomisch DNA).
P8 |Verdunningscurve om de efficiëntie van PCR te evalueren.
A. Gebruik primers voor HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA en R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC en Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (catalogusnummer 600882) voor PCR en smeltcurve-omstandigheden.
B. 100 ng RNA werd omgekeerd getranscribeerd, 2 keer verdund, en serieel verdunde cDNA-monsters werden 5 keer verdund tot 1 ng menselijk genomisch DNA.De smeltkromme wordt getoond in de inzet.
C. De RT-reactie, verdunning en seriële verdunning werden herhaald voor het tweede cDNA-monster en de resultaten waren vergelijkbaar.
P 8 toont twee standaardcurven, met dezelfde detectiemethode op twee verschillende cDNA-monsters, het resultaat is dezelfde efficiëntie, ongeveer 100%, en de R2-waarde is ook vergelijkbaar, dat wil zeggen de mate van overeenstemming tussen de experimentele gegevens en de regressielijn of de gegevens Mate van lineariteit.
De twee standaardcurven zijn vergelijkbaar, maar niet precies hetzelfde.Als het de bedoeling is om het doel nauwkeurig te kwantificeren, moet worden opgemerkt dat het onaanvaardbaar is om een berekening van het aantal kopieën te geven zonder de onzekerheid uit te leggen
P9 |Meetonzekerheid geassocieerd met kwantificering met behulp van een standaardcurve.
A. Gebruik primers voor GAPDH (NM_002046) om PCR- en smeltcurve-omstandigheden uit te voeren.F: ACAGTTGCCATGTAGACC en R: TAACTGGTTGAGCACAGG en Bioline's Sensifast SYBR mastermix (catalogusnummer BIO-98050).
B. Amplificatiegrafiek, smeltkromme en standaardkromme opgenomen met Bio-Rad's CFX qPCR-instrument.
C. Standaard curvegrafiek en 95% betrouwbaarheidsinterval (BI).
D. Het aantal kopieën en het 95%-betrouwbaarheidsinterval van de drie Cq-waarden afgeleid van de verdunningscurve.
P 9 laat zien dat voor een geoptimaliseerde test de inherente variabiliteit van een enkele standaardcurve ongeveer 2 keer is (95% betrouwbaarheidsinterval, minimum tot maximum), wat misschien wel de kleinste variabiliteit is die kan worden verwacht.
Gerelateerd product:
Posttijd: 30 sept.2021
