RT-qPCR is het basisexperiment van de moleculaire biologie en iedereen moet ermee vertrouwd zijn.Het omvat voornamelijk drie stappen: RNA-extractie, reverse transcriptie in cDNA en real-time fluorescerende kwantitatieve PCR.Het helpt niet, wat is er aan de hand?Grote kans dat er een probleem mee ishet omgekeerde transcriptie-experiment!Hoewel het erop lijkt dat het omgekeerde transcriptie-experiment alleen RNA, dNTP, primers enomgekeerde transcriptasenaar de centrifugebuis en meng goed, maar in het daadwerkelijke werkingsproces zijn er nog veel details waar aandacht aan moet worden besteed.Laten we er meer over leren!

Hoe de kwaliteit van RNA beoordelen?
Om cDNA te verkrijgen, is de kwaliteit van RNA van cruciaal belang!RNA-kwaliteit kan voornamelijk worden gedetecteerd aan de hand van twee aspecten:
(1) RNA-integriteit:RNA-integriteit kan worden geverifieerd door middel van agarosegelelektroforese. Als we eukaryoten als voorbeeld nemen, heeft het volledige totale RNA drie duidelijke banden, de molecuulgewichten van groot naar klein zijn 28S, 18S en 5S, en 28S is twee keer zo helder als 18S;als er drie banden te zien zijn, maar het bandtype wazig is of diffusie betekent dat het RNA gedeeltelijk is afgebroken.Voer op dit moment de omgekeerde transcriptiereactie onmiddellijk uit en verhoog de sjablooninvoer op de juiste manier;als alleen een band met een klein molecuulgewicht of geen band te zien is, is het RNA volledig afgebroken en moet het opnieuw worden geëxtraheerd.Agilent 2100 geeft de integriteit van RNA aan met piekdiagram en RIN-waarde.Als het nucleïnezuur intact is, is de basislijn van het elektroferogram vlak;als het nucleïnezuur ernstig wordt afgebroken, is de basislijn ongelijk en verschijnen er meer afbraakpieken;de waarde van RIN weerspiegelt de integriteit van het RNA, binnen het bereik van 0-10, hoe groter de waarde, hoe beter de kwaliteit van het RNA.Nou, hoe hoger de mate van volledigheid.
(2) Zuiverheid van RNA:De verhouding van OD260/280 kan worden gedetecteerd door UV-spectrofotometrie.Als de verhouding OD260/280 tussen 1,9 en 2,1 ligt, is de zuiverheid zeer goed.
Resterend genomisch DNA kan leiden tot onnauwkeurige kwantitatieve resultaten
Wanneer RNA wordt geëxtraheerd, kan het RNA dat we krijgen worden gemengd met genomisch DNA (gDNA) dat niet is opgeschoond.Daarom zal het cDNA na reverse transcriptie ook mee vermengd wordengDNA.Tijdens de stroomafwaartsqPCRreactie,cDNAen gDNA kan tegelijkertijd worden geamplificeerd, wat resulteert in een relatief kleine CT-waarde, dus de resultaten kunnen vertekend zijn.
Dus wat moeten we doen in deze situatie?Foregenestelt voor:
(1) Voer genoomreiniging uit op het omgekeerde RNA, dat kan worden verwijderd door kolomextractie tijdens RNA-extractie;
(2) Behandel het geëxtraheerde RNA met DNaseI , maar beëindig het met EDTA;
van reverse transcriptie-reagentiamet genoomopruimingsmodules;

Hoe primers voor reverse transcriptie kiezen?
Omgekeerde transcriptieprimers hebben ook invloed op de uitkomst van de omgekeerde transcriptiereactie.U kunt willekeurige primers, Oligo dT of genspecifieke primers voor reverse transcriptie kiezen, afhankelijk van de specifieke omstandigheden van het experiment:
(1) Specifieke transcripties: genspecifieke primers worden aanbevolen;
(2) Transcripten van lange fragmenten: Oligo dT/genspecifieke primers worden aanbevolen;
(3) Interne fragmenten van transcripties met lange segmenten: genspecifieke primers/willekeurige primers/willekeurige primers + Oligo dT.Als het daaropvolgende qPCR-experiment wordt uitgevoerd, kan Oligo dT niet alleen worden gebruikt, omdat het gebruik van Oligo dT alleen 3'-uiteindebias kan veroorzaken, wat leidt tot onnauwkeurige qPCR-experimentresultaten;
(4) miRNA: Stem-loop primers of tailing primers kunnen worden gebruikt.

Hoe vaak moet het reverse transcriptieproduct cDNA worden verdund voor kwantificering?
Na het verkrijgen van het cDNA van het reverse transcriptieproduct, is het erg belangrijk hoe vaak het cDNA moet worden verdund voor qPCR-experimenten.Als de cDNA-concentratie te hoog of te laag is, kan de efficiëntie van de amplificatie worden beïnvloed.Kan de cDNA-concentratie worden gemeten en hoe moet dit worden gedaan?
(1) De cDNA-concentratie van het reverse transcriptieproduct kan niet worden gemeten, omdat het reverse transcriptieproduct naast het cDNA-product ook reverse transcriptie-residubuffer, reverse transcriptase, primers enz.Op dit moment zullen sommige vrienden zeggen, dan zal ik de concentratie na zuivering meten;hier wil Foregene eraan herinneren dat het niet wordt aanbevolen om het cDNA te zuiveren, omdat de lengte van het cDNA dat wordt verkregen door de omkering anders is en het korte cDNA verloren gaat bij de zuivering.
(2) Dus wat te doen?Voorafgaand aan het qPCR-experiment kan via het pre-experiment de verdunningsgradiënt van het cDNA worden bepaald.Gebruik bijvoorbeeld cDNA-voorraadoplossing, 10-voudige verdunning en 100-voudige verdunning als sjablonen voor qPCR-experimenten en selecteer de verdunningsfactor met een CT-waarde in het bereik van 18-28.

Hoe moeten miRNA's omgekeerd worden getranscribeerd?
miRNA is een enkelstrengig klein molecuul-RNA met een grootte van ongeveer 22 nt dat niet codeert voor eiwit.Vanwege zijn korte lengte is de conventionele qPCR-methode moeilijk om deze direct te kwantificeren, dus is het vaak nodig om miRNA uit te breiden;de veelgebruikte reverse transcriptiemethoden voor miRNA omvatten de stem-loop-methode en de tailing-methode.
De stam-lus-methode is om het miRNA uit te breiden door stam-lus-primers toe te voegen.Deze detectiemethode heeft een hogere gevoeligheid en specificiteit, maar de detectiedoorvoer is laag.Eén omgekeerde transcriptie kan slechts één miRNA en een interne referentie detecteren;de methode voor het toevoegen van staarten bestaat uit twee Het wordt voltooid door de gezamenlijke werking van twee enzymen, namelijk PolyA-polymerase en reverse transcriptase.PolyA-polymerase is verantwoordelijk voor het toevoegen van PolyA-staarten aan miRNA om de lengte te vergroten, en reverse transcriptase voert een reverse transcriptiereactie uit.Deze methode heeft een hoge detectiedoorvoer en kan meerdere miRNA's en interne referenties in één omgekeerde transcriptie detecteren, maar de gevoeligheid en specificiteit zijn laag in de stem-loop-methode.