Ook bij qPCR-experimenten is het ontwerp van de primer een zeer belangrijke schakel.Of de primers al dan niet geschikt zijn, hangt nauw samen met het feit of de amplificatie-efficiëntie de norm bereikt, of de geamplificeerde producten specifiek zijn en of de experimentele resultaten beschikbaar zijn.
Dus hoe de specificiteit van de qPCR-primer te verbeteren?Hoge versterkingsefficiëntie?
Vandaag nemen we je mee om samen qPCR-primers te ontwerpen, en laten we het ontwerpen van qPCR-primers een efficiënte vaardigheid in experimenten worden.
Let bij het ontwerpen van qPCR-primers meestal op de volgende punten: primers moeten zoveel mogelijk over introns worden ontworpen, de productlengte moet 100-300 bp zijn, de Tm-waarde moet zo dicht mogelijk bij 60 ° C liggen, en de stroomopwaartse en stroomafwaartse primers moeten zo dicht mogelijk bij elkaar liggen en het einde van de primer moet G of C zijn, enz. Wacht.
1. Ontwerp van primers die introns overspannen
Bij het ontwerpen van qPCR-primers kan het kiezen van primers die over introns zijn ontworpen, voorkomen dat de gDNA-template wordt geamplificeerd, en de producten zijn allemaal afgeleid van de amplificatie van cDNA, waardoor de invloed van gDNA-verontreiniging wordt geëlimineerd.
2. Primer lengte
De lengte van de primer ligt in het algemeen tussen 18-30 nt, en de lengte van het amplificatieproduct moet zoveel mogelijk tussen 100-300 bp worden geregeld.
Als de primer te kort is, zal deze leiden tot niet-specifieke amplificatie en als deze te lang is, zal deze gemakkelijk een secundaire structuur vormen (zoals een haarspeldstructuur).Als het amplificatieproduct te lang is, is het niet geschikt voor de reactie van polymerase, wat de efficiëntie van PCR-amplificatie zal beïnvloeden.
3. GC-gehalte en Tm-waarde
Het GC-gehalte van primers moet worden gecontroleerd tussen 40% en 60%.Als het te hoog of te laag is, is het niet bevorderlijk voor het initiëren van de reactie.Het GC-gehalte van de voorwaartse en achterwaartse primers moet bijna hetzelfde zijn om dezelfde Tm-waarde en annealingstemperatuur te verkrijgen.
De Tm-waarde moet zo veel mogelijk tussen 55-65°C liggen, in het algemeen rond de 60°C, en de Tm-waarde van stroomopwaarts en stroomafwaarts moet zo dicht mogelijk bij elkaar liggen, bij voorkeur niet meer dan 4°C.
4. Vermijd het selecteren van A aan het 3'-uiteinde van de primer
Wanneer het 3'-uiteinde van de primer niet overeenkomt, zijn er grote verschillen in de synthese-efficiëntie van verschillende basen.Wanneer de laatste base A is, kan het ook kettingsynthese initiëren, zelfs in het geval van mismatching, en wanneer de laatste base T When is, wordt de efficiëntie van mismatch-inductie sterk verminderd.Probeer daarom A te vermijden aan het 3'-uiteinde van de primer, en het is beter om T te kiezen.
Als het een probe-primer is, kan het 5'-uiteinde van de probe niet G zijn, want zelfs wanneer een enkele G-base is verbonden met de FAM-fluorescerende reportergroep, kan G ook het door de FAM-groep uitgezonden fluorescentiesignaal doven, wat resulteert in vals-negatieve resultaten.Verschijnen.
5. Basis distributie
De verdeling van de vier basen in de primer is bij voorkeur willekeurig, waarbij meer dan 3 opeenvolgende G of C aan het 3'-uiteinde worden vermeden, en meer dan 3 opeenvolgendeG of C zijn eenvoudig te koppelen in het GC-rijke sequentiegebied.
6. Het primerontwerpgebied moet complexe secundaire structuren vermijden.
De secundaire structuur gevormd door de enkele streng van het amplificatieproduct zal het soepele verloop van PCR beïnvloeden.Door vooraf te voorspellen of er een secundaire structuur in de targetsequentie zit, probeer je deze regio te vermijden bij het ontwerpen van primers.
7. De primers zelf en tussen de primers moeten proberen opeenvolgende complementaire basen te vermijden.
Er kan geen opeenvolgende complementariteit van 4 basen zijn tussen de primer zelf en de primer.De primer zelf mag geen complementaire sequentie hebben, anders zal hij zichzelf vouwen om een ​​haarspeldstructuur te vormen, wat de annealing-combinatie van de primer en de template zal beïnvloeden.
Complementaire sequenties kunnen niet bestaan ​​tussen stroomopwaartse en stroomafwaartse primers.Complementariteit tussen primers zal primerdimeren produceren, die de PCR-efficiëntie verminderen en zelfs de kwantitatieve nauwkeurigheid beïnvloeden.Als de primer-dimeer- en haarspeldstructuren onvermijdelijk zijn, mag de △G-waarde niet te hoog zijn (moet lager zijn dan 4,5 kcal/mol).
8. De primers versterken het doelspecifieke product.
Het uiteindelijke doel van qPCR-detectie is om de overvloed van het doelgen te begrijpen.Als niet-specifieke amplificatie optreedt, zal de kwantificering onnauwkeurig zijn.Daarom moeten de primers, nadat ze zijn ontworpen, worden getest door BLAST en wordt de specificiteit van de producten vergeleken in de sequentiedatabase.
Vervolgens nemen we het menselijke GAS6-gen (Growth arrest specific 6) als voorbeeld om qPCR-primers te ontwerpen.
01 query-gen
Homo GAS6via NCBI.Hier moeten we aandacht besteden aan het vergelijken van de gennaam en soort om ervoor te zorgen dat ze consistent zijn.
02 Zoek de gensequentie
(1) Als de doelsequentie genomisch DNA is, selecteer dan de eerste, dat is de genomische DNA-sequentie van het gen.
(2) Als de doelsequentie mRNA is, selecteer dan de tweede.Klik na het invoeren op “CDS” in onderstaande tabel.De bruine achtergrondsequentie is de coderende sequentie van het gen.
03 Ontwerpprimers
Ga naar de Primer-BLAST-interface
Voer linksboven het gensequentienummer of de sequentie in Fasta-formaat in en vul de relevante parameters in.

Klik op "Get primers" en NCBI verschijnt om u te vertellen dat een dergelijke parameterselectie zal worden versterkt voor andere splitsingsvarianten.We kunnen de verschillende splitsingsvarianten controleren en indienen om het juiste primerpaar te krijgen (zoals weergegeven in de onderstaande afbeelding).Dit proces kan tientallen seconden duren.
De annealingstemperaturen van deze primerparen liggen allemaal rond de 60°C.Kies, afhankelijk van het doel van het experiment, primers met een gemiddelde lengte, goede specificiteit en minder zelfaanvulling van de primers voor het experiment, en het slagingspercentage is vrij hoog!
04Primer-specificiteitsverificatie
Sterker nog, naast het ontwerpen van primers kan Primer-Blast ook de door ons ontworpen primers beoordelen.Keer terug naar de primer-ontwerppagina, voer de stroomopwaartse en stroomafwaartse primers in die we hebben ontworpen en andere parameters worden niet aangepast.Na het indienen kun je zien of het primerpaar ook op andere genen voorkomt.Als ze allemaal worden weergegeven op het gen dat we willen amplificeren , wat aangeeft dat de specificiteit van dit paar primers geweldig is!(Dit is bijvoorbeeld het enige resultaat van de primerquery!)

05 Primer kwaliteitsoordeel
Wat voor soort primer is de "perfecte" primer die "amplificatie-efficiëntie tot standaard", "versterkte productkenmerken" en "betrouwbare experimentele resultaten" combineert?
Versterkingsefficiëntie

smeltkromme
De amplificatie-efficiëntie van de primers bereikt 90%-110%, wat betekent dat de amplificatie-efficiëntie goed is, en de smeltkromme heeft een enkele piek en gewoonlijk Tm>80°C, wat betekent dat de amplificatie-specificiteit goed is.
 
Gerelateerde producten:
Realtime PCR Easy–SYBR GREEN I
Realtime PCR Easy-Taqman