Onlangs ontdekte ik iets geweldigs!Veel gevorderde experimentprofessionals om hem heen kennen niet eens enkele zeer elementaire experimentele kennispunten.

Kunt u bijvoorbeeld de volgende vragen beantwoorden?

Is er een verschil tussen OD260 en A260?Wat betekent elk?
OD is de afkorting van optische dichtheid (optische dichtheid), A is de afkorting van absorptie (absorptie), de twee concepten zijn eigenlijk hetzelfde, "optische dichtheid" is "absorptie", maar "optische dichtheid" is in overeenstemming met de meeste nationale normen en meer gestandaardiseerd.

Gewoonlijk meten we de OD-waarde bij 260 nm om de nucleïnezuurconcentratie te berekenen, dus wat stelt 1OD voor?
Nucleïnezuur heeft een maximale absorptiepiek bij een golflengte van 260 nm, die zowel DNA als RNA bevat, evenals gefragmenteerde nucleïnezuurfragmenten (dit is het belangrijkste punt).
De OD-waarde gemeten bij een golflengte van 260 nm werd geregistreerd als OD260.Als het monster zuiver is, kan de OD260-waarde de concentratie van het nucleïnezuurmonster berekenen.
1 OD260=50 μg/ml dsDNA (dubbelstrengs DNA)
=37 μg/ml ssDNA (enkelstrengig DNA)
= 40 µg/ml RNA
=30 μg/ml dNTP's (oligonucleotiden)
Is er enig verband en verschil tussen RT-PCR, Realtime-PCR en QPCR?
RT-PCR is de afkorting van Reverse Transcription PCR
Real Time PCR=qPCR, afkorting van Quantitative Real Time PCR
Hoewel Real Time PCR (real-time fluorescente kwantitatieve PCR) en Reverse Transcription PCR (reverse transcription PCR) beide lijken te worden afgekort als RT-PCR.Maar de internationale conventie is: RT-PCR verwijst specifiek naar reverse transcriptie-PCR.

Wat zijn de algemeen gebruikte nt, bp en kb om de lengte van DNA/RNA in de biologie te beschrijven?
nt = nucleotide
bp = basenpaar basenpaar
kb = kilobase

Je zou natuurlijk zeggen dat veel mensen zich niets aantrekken van deze kleine details!Iedereen doet dit, en niemand zal je vragen wat het is.Je weet dat dit niet nodig is, toch?

Nee, nee, nee, het is zeer noodzakelijk om dit te weten!waardoor?
Omdat je een artikel wilt plaatsen!Broer!Of je nu afstudeert of wetenschappelijke onderzoeksprestaties nastreeft, je moet op artikelen vertrouwen om te spreken!

Nucleïnezuurextractie zou het eenvoudigste en meest basale experiment moeten zijn.De kwaliteit van de nucleïnezuurextractie bepaalt rechtstreeks de resultaten van daaropvolgende experimenten.

Hoewel ik het vaak heb gezegd, zijn er nog steeds veel vrienden die er niets om geven.Deze keer heb ik besloten om het artikel te verlaten!

Minimale informatie voor publicatie van kwantitatieve real-time PCR-experimenten, ook wel MIQE genoemd, is een reeks internationaal gelanceerde richtlijnen voor kwantitatieve experimenten met fluorescentie, die minimumnormen voorstellen voor de experimentele informatie die nodig is voor het evalueren van kwantitatieve PCR-experimenten met fluorescentie en het publiceren van artikelen.Door de experimentele omstandigheden en analysemethoden die door de onderzoeker worden verstrekt, kunnen de beoordelaars de validiteit van het experimentele schema van de onderzoeker beter evalueren.

Het is te zien dat in de sectie nucleïnezuurextractie de volgende detectie-items zijn voorgesteld,

"E" geeft informatie aan die moet worden verstrekt en "D" geeft informatie aan die indien nodig moet worden verstrekt.

Het formulier is erg ingewikkeld, sterker nog, ik wil zeggen dat iedereen moet beginnen

zuiverheid (D), opbrengst (D), integriteit (E) en consistentie (E) om nucleïnezuren in deze vier aspecten te evalueren.

Volgens experimentele gewoonten, praat eerst over de evaluatiemethoden van zuiverheid en concentratie.

OD-meting is de favoriete en gemakkelijkste detectiemethode voor onderzoekers.Wat het principe betreft, ik zal hier niet in details treden.Veel laboratoria gebruiken nu ultramicrospectrofotometers om nucleïnezuurmonsters direct kwantitatief te analyseren.Terwijl de absorptiewaarde wordt weergegeven, geeft het programma direct de concentratiewaarde (nucleïnezuur, eiwit en fluorescerende kleurstof) en gerelateerde verhoudingen.Wat betreft de analyse van de OD-waarde, sla deze foto op en het komt goed.

Universele OD-waarde-oplossingslijst

Er zijn echter enkele kanttekeningen die apart voor u naar voren moeten worden gebracht.

(Ik weet tenslotte dat jij degenen moet zijn die sparen en wachten tot je ze nodig hebt!)

Opmerking 1 Apparatuur

De OD-waarde wordt beïnvloed door verschillende apparatuur.Zolang de OD260 zich binnen een bepaald bereik bevindt, zijn de waarden van OD230 en OD280 zinvol.Het absorptiebereik van de gewone Eppendorf D30 bij 260 nm is bijvoorbeeld 0 ~ 3A en de NanoDrop One van Thermo ligt bij 260 nm.Het absorptiebereik van 0,5 ~ 62,5A.

Opmerking 2Verdunningsreagens

De OD-waarde kan worden beïnvloed door de verdunning van verschillende reagentia.Bijvoorbeeld de OD260/280-aflezing van gezuiverd RNA in pH7,5 10 mM Trisbuffer ligt tussen 1.9-2.1, terwijl inneutrale waterige oplossingde verhouding zal lager zijn, misschien slechts 1,8-2,0, maar dit betekent niet dat de kwaliteit van RNA verandert Verschil.

Notitie 3Reststoffen

De aanwezigheid van reststoffen zal de nauwkeurigheid van de meting van de nucleïnezuurconcentratie beïnvloeden, dus het is noodzakelijk om eiwit-, fenol-, polysaccharide- en polyfenolresiduen in nucleïnezuurmonsters zoveel mogelijk te vermijden.

In feite is extractie met organische reagentia echter een oude methode.In commerciële kits kan het extractie-effect worden bereikt door middel van een adsorptiekolom op silicabasis in combinatie met centrifugatie, waarbij giftige en schadelijke organische reagentia worden vermeden die moeilijk te verwijderen zijn, enz. Het probleem, zoalsDe nucleïnezuurextractiekit van Foregene gebruikt geen DNase/RNase en giftige organische reagentia tijdens de hele operatie, snel en veilig, en dewerking isGoed(zei per ongeluk dat het kaal was, maar ik weet dat je dat wilt weten).

Voorbeeld 1: Opbrengst en zuiverheid van genoom-DNA-extractie

Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) behandelt bodemmonsters van verschillende bronnen, en de hoeveelheid en zuiverheid van verkregen genomisch DNA wordt weergegeven in de volgende tabel:
Voorbeeld 2: Opbrengst en zuiverheid van weefsel-RNA-extractie

Animal Total RNA Isolation Kit (RE-03012) verwerkte verschillende weefselmonsters en de hoeveelheid en zuiverheid van het verkregen RNA worden weergegeven in de onderstaande tabel (voor muizenweefsel):
Denk echter niet dat je klaar bent met de OD-waarde.Heb je enige aandacht voor de belangrijkste punten die ik voor je heb getekend?

Kennisgeving

Gefragmenteerde nucleïnezuurmoleculen zullen ook worden berekend in de absorptie.Ervan uitgaande dat u genomische DNA-residuen in het RNA heeft, zal uw OD-waarde erg hoog lijken, maar de werkelijke concentratie van RNA kan niet worden bepaald.Of uw RNA is Het is niet duidelijk of er sprake is van afbraak, dus we hebben nog steeds een uitgebreide evaluatiemethode nodig om een ​​nauwkeuriger oordeel te kunnen geven, dat wil zeggen de nucleïnezuurintegriteitsevaluatie die wordt genoemd in MIQE.