Ⅰ. Verhoog de gevoeligheid van het reactiesysteem:

1. Scheid RNA van hoge kwaliteit:

Succesvolle cDNA-synthese is afkomstig van RNA van hoge kwaliteit.Hoogwaardig RNA moet in ieder geval in totaal langer zorgen en bevat geen remmers die geen opname-enzymen bevatten, zoals EDTA of SDS.De kwaliteit van RNA bepaalt de maximale waarde van de sequentie-informatie die u naar het cDNA kunt transcriberen.De algemene RNA-zuiveringsmethode is een stapsgewijze methode om isoocyanaat/acidofenol te gebruiken.Om de vervuiling van RNase te voorkomen, vereist het RNA dat wordt afgescheiden van een monster dat rijk is aan RNase (zoals pancreas), opslag van formaldehyde om RNA van hoge kwaliteit te behouden, wat nog meer geldt voor langdurige opslag.Het uit de rattenlever geëxtraheerde RNA was in principe afgebroken na een week bewaren in water, terwijl het uit de rattenmilt geëxtraheerde RNA stabiel bleef na drie jaar bewaren in water.Bovendien zijn transcripten groter dan 4 kb gevoeliger voor sporen van RNase-degradatie dan kleine transcripten.Om de stabiliteit van het opslag-RNA-monster te vergroten, kan het RNA worden opgelost in een methalmamine of ion en wordt het bewaard bij -70 °C.Thylide dat wordt gebruikt om RNA te bewaren, mag geen ander voorwerp bevatten dat RNA afbreekt.RNA, dat is afgeleid van de alvleesklier, kan in methalmamine minstens een jaar worden bewaard.Wanneer u klaar bent om RNA te gebruiken, kunt u de volgende methoden gebruiken om RNA te precipiteren: voeg NaCl toe aan 0,2 m en 4 keer het volume ethanol, plaats kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten en 10.000 × g centrifugaal gedurende 5 minuten.

2. Gebruik reverse transcriptase zonder RNaseH-activiteit (RNaseH-):

RNase-remmers worden vaak toegevoegd om transcriptiereacties om te keren om de lengte en opbrengst van cDNA-synthese te vergroten.RNase-remmer wordt toegevoegd in de eerste kettingsynthesereactie in aanwezigheid van buffers en reductiemiddelen zoals DTT omdat het pre-cDNA-syntheseproces de remmer denatureert, waardoor gebonden RNases vrijkomen die RNA afbreken.Eiwit-RNase-remmer voorkomt alleen de afbraak van RNA door RNase A, B, C, en voorkomt geen RNases op de huid, dus moet ervoor worden gezorgd dat ondanks het gebruik van deze remmers geen RNases uit de vingers worden geïntroduceerd.

Reverse transcriptase katalyseert de omzetting van RNA in cDNA.Zowel M-MLV als AMV hebben endogene RNaseH-activiteit naast hun eigen polymerase-activiteit.RNaseH-activiteit concurreert met polymerase-activiteit voor heterozygote strengen gevormd tussen RNA-templates en DNA-primers of cDNA-extensiestrengen, en degradeert RNA: RNA-strengen in DNA-complexen.RNA-templates die zijn afgebroken door RNaseH-activiteit kunnen niet langer worden gebruikt als effectieve substraten voor cDNA-synthese, waardoor de opbrengst en lengte van cDNA-synthese wordt verminderd.Aldus zou het elimineren of sterk verminderen van de RNaseH-activiteit van reverse transcriptase van groot voordeel zijn.

SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase van RNaseH- en thermoScript reverse transcriptase, AMV van RNaseH- leverde meer cDNA van volledige lengte op dan MMLV en AMV.De gevoeligheid van RT-PCR wordt beïnvloed door de hoeveelheid gesynthetiseerd cDNA.ThermoScript is veel gevoeliger dan AMV.De grootte van RT-PCR-producten wordt beperkt door het vermogen van reverse transcriptase om cDNA te synthetiseren, vooral bij het klonen van grotere Cdna's.In vergelijking met MMLV verhoogde SuperScripⅡ de opbrengst van lange RT-PCR-producten aanzienlijk.RNaseH-'s reverse transcriptase verhoogt ook de thermische stabiliteit, zodat de reactie kan worden uitgevoerd bij temperaturen hoger dan normaal van 37-42 ℃.Onder de voorgestelde syntheseomstandigheden werden oligo(dT)-primers en 10μCi [alpha-p]dCTP gebruikt.De totale productie van de eerste keten is berekend met behulp van de TCA-precipitatiemethode.cDNA van volledige lengte werd geanalyseerd met behulp van op grootte gesorteerde stripverwijdering en tellen in een alkalische agarosegel.

3. Verhoog de warmtebehoudstemperatuur van omgekeerde transcriptie:

Een hogere bewaartemperatuur helpt om de secundaire structuur van RNA te openen en de opbrengst van de reactie te verhogen.Voor de meeste RNA-templates worden de meeste secundaire structuren geëlimineerd door het RNA en de primer zonder buffer of zout op 65 °C te houden en ze vervolgens snel af te koelen op ijs, waardoor de primers zich kunnen binden.Sommige sjablonen hebben echter nog steeds een secundaire structuur, zelfs na thermische denaturatie.Amplificatie van deze moeilijke sjablonen kan worden uitgevoerd met behulp van ThermoScript reverse transcriptase en door de reverse transcriptase-reactie bij hogere temperaturen te plaatsen om de amplificatie te verbeteren.Hogere bewaartemperaturen kunnen ook de specificiteit verhogen, vooral wanneer cDNA-synthese wordt uitgevoerd met behulp van genspecifieke primers (GSPS) (zie hoofdstuk 3).Als u GSP gebruikt, zorg er dan voor dat de Tm-waarde van de primer gelijk is aan de verwachte bewaartemperatuur.Gebruik geen oligo(dT) en willekeurige primers boven 60℃.Willekeurige primers moeten gedurende 10 minuten op 25 ℃ worden gehouden voordat ze worden verhoogd tot 60 ℃.Naast het gebruik van hogere omgekeerde transcriptietemperaturen, kan de specificiteit worden verbeterd door het RNA/primer-mengsel rechtstreeks over te brengen van de denatureringstemperatuur van 65°C naar de bewaartemperatuur van de omgekeerde transcriptie en een voorverwarmd 2x-reactiemengsel toe te voegen (cDNA thermische initiatiesynthese).Deze aanpak helpt de intermoleculaire basenparing te voorkomen die optreedt bij lagere temperaturen.Het gebruik van een PCR-instrument vereenvoudigt de vele temperatuurschakelaars die nodig zijn voor RT-PCR.

Tth warmtegestabiliseerd polymerase werkt als DNA-polymerase in aanwezigheid van Mg2+ en RNA-polymerase in aanwezigheid van Mn2+.Het kan warmte vasthouden tot 65 ℃.De aanwezigheid van Mn2+ tijdens PCR vermindert echter de getrouwheid, waardoor Tth-polymerase minder geschikt is voor amplificatie met hoge precisie, zoals het klonen van cDNA.Bovendien is Tth minder efficiënt bij reverse transcriptie, wat de gevoeligheid vermindert, en aangezien een enkel enzym reverse transcriptie en PCR kan uitvoeren, kunnen controlereacties zonder reverse transcriptie niet worden gebruikt om geamplificeerde producten van cDNA te onderscheiden van die van besmet genomisch DNA.

4. Additief dat reverse transcriptie bevordert:

De toevoeging van additieven, waaronder glycerine en DMSO, aan de eerste kettingsynthesereactie kan de stabiliteit van de dubbele streng van het nucleïnezuur verminderen en de secundaire RNA-structuur afwikkelen.Tot 20% glycerine of 10% DMSO kan worden toegevoegd zonder de activiteit van SuperScriptⅡ of MMLV te beïnvloeden.AMV kan ook tot 20% glycerol verdragen zonder de activiteit te verminderen.Om de gevoeligheid van RT-PCR in SuperScriptⅡ reverse transcriptiereactie te maximaliseren, kan 10% glycerol worden toegevoegd en geïsoleerd bij 45 ℃.Als 1/10 van het retrotranscriptiereactieproduct aan de PCR wordt toegevoegd, is de concentratie van glycerol in de amplificatiereactie 0,4%, wat niet genoeg is om PCR te remmen.

5. RNaseH-verwerking:

De gevoeligheid kan worden verbeterd door cDNA-synthesereacties voorafgaand aan PCR met RNaseH te behandelen.Voor sommige sjablonen wordt aangenomen dat het RNA in de cDNA-synthesereactie de binding van geamplificeerde producten verhindert, in welk geval de RNaseH-behandeling de gevoeligheid kan verhogen.Over het algemeen is RNaseH-behandeling vereist voor de amplificatie van een relatief lange cDNA-doelmatrijs van volledige lengte, zoals tubereuze scherosisⅡ met weinig kopie.Voor deze moeilijke sjabloon verbeterde RNaseH het signaal dat werd gegenereerd door het cDNA dat werd gesynthetiseerd door SuperScriptⅡ of AMV.Voor de meeste RT-PCR-reacties is de RNaseH-behandeling optioneel omdat de 95°C geïsoleerde PCR-denaturatiestap typisch het RNA uit het RNA:DNA-complex hydrolyseert.

6. Verbeterde methoden voor het detecteren van kleine hoeveelheden RNA:

RT-PCR is bijzonder uitdagend wanneer slechts kleine hoeveelheden RNA beschikbaar zijn.De toevoeging van glycogeen als drager tijdens RNA-scheiding helpt de opbrengst van kleine monsters te verhogen.Gelijktijdig met Trizol kan een RNase-vrij glycogeen worden toegevoegd.Glycogeen is in water oplosbaar en kan in de waterfase blijven met RNA om te helpen bij daaropvolgende precipitatie.De aanbevolen concentratie RNase-vrij glycogeen is 250 μg/ml voor monsters van minder dan 50 mg weefsel of 106 gekweekte cellen.

De toevoeging van geacetyleerd BSA om transcriptiereacties om te keren met behulp van SuperScriptⅡ kan de gevoeligheid verhogen, en voor kleine hoeveelheden RNA kan het verminderen van de hoeveelheid SuperScriptⅡ en het toevoegen van 40 eenheden RnaseOut-nucleaseremmer het detectieniveau verbeteren.Als glycogeen wordt gebruikt bij RNA-scheiding, wordt de toevoeging van BSA- of RNase-remmers om transcriptiereacties om te keren met behulp van SuperScriptⅡ nog steeds aanbevolen.

Ⅱ. Verhoog de specificiteit van RT-PCR

1. cNDA-synthese:

Er kunnen drie verschillende methoden worden gebruikt om de cDNA-synthese van de eerste streng te initiëren, en de relatieve specificiteit van elke methode beïnvloedt de hoeveelheid en het type cDNA dat wordt gesynthetiseerd.

Random primer-methode is de minst specifieke van de drie methoden.Primers worden op meerdere plaatsen in het transcript gehybridiseerd om kort cDNA van gedeeltelijke lengte te produceren.Deze methode wordt vaak gebruikt om 5'-terminale sequenties en cDNA te verkrijgen uit RNA-templates met secundaire structurele gebieden of met terminatieplaatsen die reverse transcriptase niet kan repliceren.Om het langste cDNA te verkrijgen, moet de verhouding van primers tot RNA in elk RNA-monster empirisch worden bepaald.De beginconcentratie van willekeurige primers varieert van 50 tot 250 ng per 20 μl reactiesysteem.Omdat het cDNA dat wordt gesynthetiseerd uit totaal RNA met behulp van willekeurige primers voornamelijk ribosomaal RNA is, wordt in het algemeen poly(A)+RNA als matrijs gekozen.

Oligo(dT)-initiatie is specifieker dan willekeurige primers.Het hybridiseert met de poly(A)-staart die in de meeste eukaryote cellen aan het 3'-uiteinde van mRNA wordt aangetroffen.Omdat poly(A)+RNA ongeveer 1% tot 2% van het totale RNA uitmaakt, is de hoeveelheid en complexiteit van cDNA veel minder dan wanneer willekeurige primers zouden worden gebruikt.Vanwege zijn hoge specificiteit vereist oligo(dT) over het algemeen geen optimalisatie voor de verhouding RNA tot primer en poly(A)+-selectie.Het wordt aanbevolen om 0,5 μg oligo(dT) per 20 μl reactiesysteem te gebruiken.oligo(dT)12-18 is geschikt voor de meeste RT-PCR.Het ThermoScript RT-PCR-systeem levert oligo(dT)20 vanwege de goede thermische stabiliteit en is geschikt voor hogere bewaartemperaturen.

Genspecifieke primers (GSP) zijn de beste specifieke primers voor de reverse transcriptiestap.GSP is een antisense-oligonucleoside dat specifiek kan hybridiseren met RNA-bestemmingssequenties, in plaats van alle Rna's te versmelten zoals willekeurige primers of oligo(dT).De regels die worden gebruikt om PCR-primers te ontwerpen, zijn ook van toepassing op het ontwerp van de omgekeerde transcriptiereactie GSP.GSP kan dezelfde sequentie zijn als de amplificatieprimer die aan het einde van mRNA3' is gehybridiseerd, of GSP kan zijn ontworpen om stroomafwaarts te worden gehybridiseerd met de omgekeerde amplificatieprimer.Voor sommige geamplificeerde objecten is het nodig om meer dan één antisense-primer te ontwerpen voor succesvolle RT-PCR, omdat de secundaire structuur van het doelwit-RNA kan voorkomen dat de primer bindt.Er wordt voorgesteld om 1 pmol antisense GSP te gebruiken in het eerste kettingsynthesereactiesysteem van 20 μl.

2. Verhoog de warmtebehoudstemperatuur van omgekeerde transcriptie:

Om de GSP-specificiteit ten volle te benutten, moet reverse transcriptase met hoge thermische stabiliteit worden gebruikt.Hittestabiele reverse transcriptase kan bij hogere temperaturen worden geïsoleerd om de strengheid van de reactie te vergroten.Als een GSP bijvoorbeeld wordt gehybridiseerd bij 55 °C, wordt de specificiteit van GSP niet volledig benut als reverse transcriptie wordt uitgevoerd bij 37 °C met een lage striktheid met behulp van AMV of M-MLV.SuperScripⅡ en ThermoScript kunnen echter reageren bij 50 ℃ of hoger, waardoor niet-specifieke producten die bij lagere temperaturen worden geproduceerd, worden geëlimineerd.Voor maximale specificiteit kan het RNA/primer-mengsel direct worden overgebracht van de denaturatietemperatuur van 65°C naar de omgekeerde transcriptiehoudtemperatuur met toevoeging van een voorverwarmd 2 x reactiemengsel (thermische initiatie van cDNA-synthese).Dit helpt basenparing tussen moleculen bij lage temperaturen te voorkomen.Het gebruik van een PCR-instrument vereenvoudigt de vele temperatuurovergangen die nodig zijn voor RT-PCR.

3. Verminder genomische DNA-verontreiniging:

Een mogelijke moeilijkheid met RT-PCR is dat RNA genomisch DNA besmet.Het gebruik van betere RNA-scheidingsmethoden, zoals Trizol Reagent, vermindert genomische DNA-verontreiniging in RNA-preparaten.Om producten die zijn geproduceerd uit genomisch DNA te vermijden, kan het RNA worden behandeld met DnasⅠ van amplificatiekwaliteit om verontreinigd DNA te verwijderen voorafgaand aan reverse transcriptie.De monsters werden gedurende 10 minuten bij 65°C in 2,0 mM EDTA gehouden om de DNaseⅠ-digestie te beëindigen.EDTA cheleert magnesiumionen om de van magnesiumionen afhankelijke RNA-hydrolyse te voorkomen die optreedt bij hoge temperaturen.

Om geamplificeerd cDNA te scheiden van het genoom-DNA-amplificatieproduct, kunnen primers worden ontworpen die afzonderlijk met het gescheiden exon versmelten.PCR-producten afgeleid van cDNA zullen korter zijn dan die afgeleid van besmet genomisch DNA.Een gecontroleerd experiment zonder reverse transcriptie wordt ook uitgevoerd op elke RNA-template om te bepalen of een bepaald fragment afkomstig is van genomisch DNA of cDNA.PCR-producten die worden verkregen zonder omgekeerde transcriptie zijn afgeleid van het genoom.

Verwant product

RT-PCR Eenvoudig^ᵀᴹik (een stap)

- Met de one-step kit kunnen reverse transcriptie en PCR in dezelfde buis worden uitgevoerd.Het hoeft alleen template-RNA, specifieke PCR-primers en RNase-Free ddH toe te voegen₂O.

- Realtime kwantitatieve analyse van RNA kan snel en nauwkeurig worden uitgevoerd.

-De kit maakt gebruik van een uniek Foregene reverse transcriptiereagens en Foregene HotStar Taq DNA-polymerase gecombineerd met een uniek reactiesysteem om de amplificatie-efficiëntie en specificiteit van de reactie effectief te verbeteren.

-Het geoptimaliseerde reactiesysteem zorgt ervoor dat de reactie een hogere detectiegevoeligheid, sterkere thermische stabiliteit en betere tolerantie heeft.

RT Easy II (met GDNase) Master Premix voor eerste streng CDNA-synthese voor real-time PCR met GDNase

- Efficiënt vermogen om gDNA te verwijderen, dat binnen 2 minuten gDNA in de sjabloon kan verwijderen.

- Efficiënt reverse transcriptiesysteem, het duurt slechts 15 minuten om de synthese van de eerste cDNA-streng te voltooien.

-Complexe sjablonen: sjablonen met een hoog GC-gehalte en een complexe secundaire structuur kunnen ook met hoge efficiëntie worden omgekeerd.

- Zeer gevoelig reverse transcriptiesysteem, sjablonen op pg-niveau kunnen ook cDNA van hoge kwaliteit krijgen.

-Het reverse transcriptiesysteem heeft een hoge thermische stabiliteit, de optimale reactietemperatuur is 42 ℃ en het heeft nog steeds goede reverse transcriptieprestaties bij 50 ℃.