一、Verhoog de gevoeligheid van het reactiesysteem:

1. Isoleer RNA van hoge kwaliteit:

Succesvolle cDNA-synthese is afkomstig van RNA van hoge kwaliteit.Hoogwaardig RNA moet ten minste de volledige lengte hebben en vrij zijn van reverse transcriptaseremmers zoals EDTA of SDS.De kwaliteit van RNA bepaalt de maximale hoeveelheid sequentie-informatie die u in cDNA kunt transcriberen.Een gebruikelijke RNA-zuiveringsmethode is een eenstapsmethode met behulp van guanidine-isothiocyanaat / zure fenol.Om besmetting door sporen van RNase te voorkomen, moet RNA dat is geïsoleerd uit RNase-rijke monsters (zoals pancreas) worden opgeslagen in formaldehyde om RNA van hoge kwaliteit te behouden, vooral voor langdurige opslag.Het RNA dat uit de lever van de rat werd geëxtraheerd, werd in wezen afgebroken nadat het gedurende een week in water was bewaard, terwijl het uit de milt van de rat geëxtraheerde RNA stabiel bleef nadat het gedurende 3 jaar in water was bewaard.Bovendien zijn transcripten langer dan 4 kb gevoeliger voor afbraak door sporen-RNasen dan kleine transcripten.Om de stabiliteit van opgeslagen RNA-monsters te vergroten, kan RNA worden opgelost in gedeïoniseerd formamide en worden bewaard bij -70°C.Formamide dat wordt gebruikt om RNA te bewaren, moet vrij zijn van RNA-afbrekend afval.RNA uit de alvleesklier kan minimaal een jaar in formamide worden bewaard.Wanneer u zich voorbereidt op het gebruik van RNA, kunt u de volgende methode gebruiken om RNA te precipiteren: voeg NaCl toe tot 0,2 M en 4 keer het volume ethanol, plaats het gedurende 3-5 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 10.000 × g.

2. Gebruik de RNaseH-inactieve (RNaseH-) reverse transcriptase：

RNase-remmers worden vaak toegevoegd om transcriptiereacties om te keren om de lengte en opbrengst van cDNA-synthese te vergroten.RNase-remmers moeten tijdens de synthesereactie van de eerste streng worden toegevoegd in aanwezigheid van een buffer en een reductiemiddel (zoals DTT), omdat het proces voorafgaand aan cDNA-synthese de remmer denatureert, waardoor gebonden RNase vrijkomt dat RNA kan afbreken.Eiwit-RNase-remmers voorkomen alleen de afbraak van RNA door RNase A, B, C en voorkomen niet dat RNase op de huid terechtkomt, dus pas op dat u RNase niet met uw vingers inbrengt, ondanks het gebruik van deze remmers.

Reverse transcriptase katalyseert de omzetting van RNA naar cDNA.Zowel M-MLV als AMV hebben endogene RNaseH-activiteit naast hun eigen polymerase-activiteit.RNaseH-activiteit en polymerase-activiteit concurreren met elkaar om de hybride streng die wordt gevormd tussen de RNA-template en de DNA-primer of cDNA-extensiestreng, en degraderen de RNA-streng in het RNA:DNA-complex.De door RNaseH-activiteit afgebroken RNA-template kan niet langer dienen als een effectief substraat voor cDNA-synthese, wat de opbrengst en lengte van cDNA-synthese vermindert.Daarom zou het gunstig zijn om de RNaseH-activiteit van reverse transcriptase te elimineren of sterk te verminderen.

SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH-MMLV reverse transcriptase en thermoScript reverse transcriptase, RNaseH-AMV, kunnen meer cDNA van volledige lengte verkrijgen dan MMLV en AMV.De gevoeligheid van RT-PCR wordt beïnvloed door de hoeveelheid cDNA-synthese.ThermoScript is veel gevoeliger dan AMV.De grootte van RT-PCR-producten wordt beperkt door het vermogen van reverse transcriptase om cDNA te synthetiseren, vooral bij het klonen van grotere cDNA's.In vergelijking met MMLV verhoogde SuperScripⅡ de opbrengst van lange RT-PCR-producten aanzienlijk.De RNaseH-reverse transcriptase heeft ook een verhoogde thermostabiliteit, zodat de reactie kan worden uitgevoerd bij temperaturen hoger dan de normale 37-42°C.Gebruik onder de voorgestelde syntheseomstandigheden oligo(dT) primer en 10 μCi van [α-P]dCTP.De totale opbrengst van de eerste streng werd berekend met behulp van de TCA-precipitatiemethode.cDNA van volledige lengte werd geanalyseerd met behulp van op grootte gesorteerde banden, uitgesneden en geteld op een alkalische agarosegel.

3. Verhoog de incubatietemperatuur voor omgekeerde transcriptie:

Een hogere incubatietemperatuur helpt om de secundaire structuur van RNA te openen, waardoor de opbrengst van de reactie toeneemt.Voor de meeste RNA-templates geldt dat het incuberen van het RNA en de primers bij 65 °C zonder buffer of zout, gevolgd door snel afkoelen op ijs, de meeste secundaire structuren zal elimineren en primers zal laten binden.Sommige sjablonen hebben echter nog steeds secundaire structuren, zelfs na denaturatie door warmte.Amplificatie van deze moeilijke sjablonen kan worden uitgevoerd met behulp van ThermoScript Reverse Transcriptase en door de reverse transcriptiereactie op een hogere temperatuur te plaatsen om de amplificatie te verbeteren.Hogere incubatietemperaturen kunnen ook de specificiteit verhogen, vooral wanneer genspecifieke primers (GSP) worden gebruikt voor cDNA-synthese (zie hoofdstuk 3).Als u GSP gebruikt, zorg er dan voor dat de Tm van de primers hetzelfde is als de verwachte incubatietemperatuur.Gebruik geen oligo(dT) en willekeurige primers boven 60°C.Willekeurige primers vereisen incubatie bij 25°C gedurende 10 minuten alvorens te verhogen tot 60°C.Naast het gebruik van een hogere reverse transcriptietemperatuur, kan de specificiteit ook worden verbeterd door het RNA/primer-mengsel direct over te brengen van de denaturatietemperatuur van 65°C naar de reverse transcriptie-incubatietemperatuur en een voorverwarmd 2x-reactiemengsel toe te voegen (cDNA hot-start-synthese).Deze aanpak helpt de intermoleculaire basenparing te voorkomen die optreedt bij lagere temperaturen.De meervoudige temperatuuromschakeling die nodig is voor RT-PCR kan worden vereenvoudigd door een thermische cycler te gebruiken.

Het thermostabiele polymerase werkt als een DNA-polymerase in aanwezigheid van Mg2+ en als een RNA-polymerase in aanwezigheid van Mn2+.Het kan warm gehouden worden tot een temperatuur van maximaal 65°C.De aanwezigheid van Mn2+ tijdens PCR vermindert echter de getrouwheid, waardoor Tth-polymerase minder geschikt is voor zeer nauwkeurige amplificatie, zoals het klonen van cDNA.Bovendien heeft Tth een lage reverse transcriptie-efficiëntie, wat de gevoeligheid vermindert, en aangezien reverse transcriptie en PCR kunnen worden uitgevoerd met een enkel enzym, kunnen controlereacties zonder reverse transcriptie niet worden gebruikt om cDNA-amplificatieproducten te vergelijken met verontreinigend genomisch DNA.De amplificatieproducten werden gescheiden.

4. Additieven die reverse transcriptie bevorderen:

Additieven, waaronder glycerol en DMSO, worden toegevoegd aan de synthesereactie van de eerste streng, die de stabiliteit van de dubbelstrengs nucleïnezuur kan verminderen en de secundaire structuur van RNA kan losmaken.Tot 20% glycerol of 10% DMSO kan worden toegevoegd zonder SuperScript II- of MMLV-activiteit te beïnvloeden.AMV kan ook tot 20% glycerol verdragen zonder verlies van activiteit.Om de gevoeligheid van RT-PCR in de SuperScriptⅡ reverse transcriptiereactie te maximaliseren, kan 10% glycerol worden toegevoegd en geïncubeerd bij 45°C.Als 1/10 van het reverse transcriptiereactieproduct wordt toegevoegd aan PCR, dan is de concentratie van glycerol in de amplificatiereactie 0,4%, wat niet genoeg is om PCR te remmen.

5. RNaseH-traktatie:

Behandeling van cDNA-synthesereacties met RNaseH voorafgaand aan PCR kan de gevoeligheid verhogen.Voor sommige sjablonen wordt aangenomen dat RNA in de cDNA-synthesereactie de binding van amplificatieproducten voorkomt, in welk geval RNaseH-behandeling de gevoeligheid kan verhogen.Over het algemeen is RNaseH-behandeling noodzakelijk bij het amplificeren van langere cDNA-doelsjablonen van volledige lengte, zoals tubereuze scherosis II met weinig kopieën.Voor deze moeilijke sjabloon verbeterde RNaseH-behandeling het signaal geproduceerd door SuperScript II of AMV-gesynthetiseerd cDNA.Voor de meeste RT-PCR-reacties is RNaseH-behandeling optioneel, omdat de PCR-denaturatiestap bij 95°C in het algemeen het RNA in het RNA:DNA-complex hydrolyseert.

6. Verbetering van de kleine RNA-detectiemethode:

RT-PCR is vooral een uitdaging wanneer er slechts kleine hoeveelheden RNA beschikbaar zijn.Glycogeen toegevoegd als drager tijdens RNA-isolatie helpt om de opbrengst van kleine monsters te verhogen.RNase-vrij glycogeen kan tegelijkertijd met Trizol worden toegevoegd.Glycogeen is in water oplosbaar en kan in de waterige fase met RNA worden gehouden om latere precipitatie te bevorderen.Voor monsters van minder dan 50 mg weefsel of 106 gekweekte cellen is de aanbevolen concentratie RNase-vrij glycogeen 250 μg/ml.

Het toevoegen van geacetyleerd BSA aan de omgekeerde transcriptiereactie met behulp van SuperScript II kan de gevoeligheid verhogen, en voor kleine hoeveelheden RNA kan het verminderen van de hoeveelheid SuperScript II en het toevoegen van 40 eenheden RNaseOut-nucleaseremmer het detectieniveau verhogen.Als glycogeen wordt gebruikt in het RNA-isolatieproces, wordt het nog steeds aanbevolen om BSA of RNase-remmer toe te voegen bij gebruik van SuperScript II voor reverse transcriptiereactie.

、 Verhoog de RT-PCR-specificiteit

1. CND-Asynthese:

De synthese van de eerste streng cDNA kan worden gestart met behulp van drie verschillende methoden, waarvan de relatieve specificiteit de hoeveelheid en het type gesynthetiseerd cDNA beïnvloedt.

De willekeurige primermethode was de minst specifieke van de drie methoden.Primers versmelten op meerdere plaatsen in het transcript, waardoor korte cDNA's van gedeeltelijke lengte worden gegenereerd.Deze methode wordt vaak gebruikt om sequenties van het 5'-uiteinde te verkrijgen en om cDNA te verkrijgen uit RNA-templates met gebieden met een secundaire structuur of met terminatieplaatsen die niet kunnen worden gerepliceerd door reverse transcriptase.Om het langste cDNA te verkrijgen, moet de verhouding van primers tot RNA in elk RNA-monster empirisch worden bepaald.De startconcentratie van willekeurige primers varieerde van 50 tot 250 ng per 20 μl reactie.Aangezien cDNA dat is gesynthetiseerd uit totaal RNA met behulp van willekeurige primers voornamelijk ribosomaal RNA is, wordt in het algemeen poly(A)+RNA als matrijs gekozen.

Oligo(dT)-primers zijn specifieker dan willekeurige primers.Het hybridiseert met de poly(A)-staart aan het 3'-uiteinde van de meeste eukaryote mRNA's.Omdat poly(A)+ RNA ongeveer 1% tot 2% van het totale RNA uitmaakt, is de hoeveelheid en complexiteit van cDNA veel minder dan bij willekeurige primers.Vanwege zijn hoge specificiteit vereist oligo(dT) over het algemeen geen optimalisatie van de verhouding van RNA tot primers en poly(A)+ selectie.Het wordt aanbevolen om 0,5 μg oligo(dT) per 20 μl reactiesysteem te gebruiken.oligo(dT)12-18 is geschikt voor de meeste RT-PCR.Het ThermoScript RT-PCR-systeem biedt oligo(dT)20 vanwege de betere thermische stabiliteit voor hogere incubatietemperaturen.

Genspecifieke primers (GSP) zijn de meest specifieke primers voor de reverse transcriptiestap.GSP is een antisense-oligonucleotide dat specifiek kan hybridiseren met de RNA-doelsequentie, in tegenstelling tot willekeurige primers of oligo(dT), die aan alle RNA's hechten.Dezelfde regels die worden gebruikt om PCR-primers te ontwerpen, zijn van toepassing op het ontwerp van GSP in reverse transcriptiereacties.De GSP kan dezelfde sequentie zijn als de amplificatieprimer die hecht aan het meest 3'-uiteinde van het mRNA, of de GSP kan worden ontworpen om stroomafwaarts van de omgekeerde amplificatieprimer te gloeien.Voor sommige geamplificeerde proefpersonen moet meer dan één antisense-primer worden ontworpen voor succesvolle RT-PCR omdat de secundaire structuur van het doelwit-RNA primerbinding kan voorkomen.Het wordt aanbevolen om 1 pmol antisense GSP te gebruiken in een synthesereactie van de eerste streng van 20 μl.

2. Verhoog de incubatietemperatuur voor omgekeerde transcriptie:

Om volledig te profiteren van het volledige voordeel van GSP-specificiteit, moet een reverse transcriptase met een hogere thermostabiliteit worden gebruikt.Thermostabiele reverse transcriptases kunnen bij hogere temperaturen worden geïncubeerd om de reactiestrengheid te verhogen.Als een GSP bijvoorbeeld uitgloeit bij 55°C, zal de specificiteit van het GSP niet volledig worden benut als AMV of M-MLV wordt gebruikt voor reverse transcriptie bij een lage stringentie van 37°C.SuperScript II en ThermoScript kunnen echter reageren bij 50°C of hoger, waardoor niet-specifieke producten die bij lagere temperaturen worden gegenereerd, worden geëlimineerd.Voor maximale specificiteit kan het RNA/primer-mengsel direct worden overgebracht van de denaturatietemperatuur van 65 °C naar de omgekeerde transcriptie-incubatietemperatuur en worden toegevoegd aan een voorverwarmd 2x reactiemengsel (cDNA-synthese hot start).Dit helpt intermoleculaire basenparing bij lage temperaturen te voorkomen.De meerdere temperatuurovergangen die nodig zijn voor RT-PCR kunnen worden vereenvoudigd door een thermische cycler te gebruiken.

3. Vermindert genomische DNA-verontreiniging:

Een mogelijke moeilijkheid die men tegenkomt bij RT-PCR is de besmetting van genomisch DNA in het RNA.Het gebruik van een goede RNA-isolatiemethode, zoals Trizol-reagens, vermindert de hoeveelheid genomisch DNA die het RNA-preparaat verontreinigt.Om producten die zijn afgeleid van genomisch DNA te vermijden, kan RNA worden behandeld met DNase I van amplificatiekwaliteit om verontreinigend DNA te verwijderen voorafgaand aan reverse transcriptie.De DNase I-digestie werd beëindigd door de monsters gedurende 10 minuten bij 65°C in 2,0 mM EDTA te incuberen.EDTA kan magnesiumionen cheleren, waardoor magnesiumionafhankelijke RNA-hydrolyse bij hoge temperaturen wordt voorkomen.

Om geamplificeerd cDNA te scheiden van verontreinigende genomische DNA-amplificatieproducten, kunnen primers worden ontworpen die elk hybridiseren om exons te scheiden.PCR-producten afgeleid van cDNA zullen korter zijn dan die afgeleid van besmet genomisch DNA.Bovendien werd een controle-experiment zonder omgekeerde transcriptie uitgevoerd op elke RNA-matrijs om te bepalen of een bepaald fragment afkomstig was van genomisch DNA of cDNA.Het verkregen PCR-product zonder reverse transcriptie is afgeleid van het genoom.