Iedereen heeft het over het principe van qRT-PCR-experiment, primerontwerp, resultaatinterpretatie, enz., maar ik denk dat ik de experimentele werking van qRT-PCR met u moet delen.Het is klein, maar het gaat om resultaat.
Voordat we qRT-PCR gaan doen, moeten we een duidelijk begrip hebben van ons eigen RNA en onze werkingsmethoden.Onze inspanningen zijn immers gericht op het behalen van resultaten, niet alleen op oefenen.Dus voordat we qRT-PCR uitvoeren, moeten we de volgende problemen bepalen (waarvan sommige alleen van toepassing zijn op SYBR).
1 Weet je zeker dat je RNA niet is afgebroken?
NanoDrop 2000 kan alleen de concentratie en zuiverheid van RNA detecteren, maar kan de integriteit van RNA niet detecteren.
De RNA-waarde (RNA Intesity Number) kan de integriteit van het RNA weerspiegelen, dat wordt gedetecteerd door het Agilent 2100 Bioanalyzer-systeem.
Fig. Schematisch diagram van RIN-waarden voor verschillende RNA-monsters (eukaryotes)
Laboratoria hebben over het algemeen echter geen Agilent 2100 Bioanalyzer.In dit geval kunnen we detecteren via formaldehydegel, maar de vereiste voor de totale hoeveelheid RNA is hoog, dus de snelste methode is om gewone gelelektroforese te gebruiken.Het is vereist om in een nuclease-vrije omgeving te zijn, dus het is noodzakelijk om de elektroforesetank, solfles, gelbeugel en kam met DEPC-water te spoelen.De agarose is ook nucleasevrij (zolang deze vers is geopend) en de Loading Buffer moet zoveel mogelijk vers worden geopend, met 1,2% gel.
Merk op dat de gel volledig moet zijn opgelost, anders veroorzaakt het inhomogene banden, zoals weergegeven in voorbeeld 9 in de afbeelding.Als de spanning te hoog is of te lang wordt gebruikt, wordt warmte gegenereerd en RNA-degradatie veroorzaakt, dus de spanning en tijd moeten redelijk worden gecontroleerd.Bovendien kan gelrunning ook verder bepalen of er DNA-residu in het monster aanwezig is en observeren of er een groot aantal vastgehouden banden in de doseerput zit.
Figuur.Gelelektroforese detectie van RNA
2 Ben je zeker van de concentratie van je cDNA?
De ervaring van de grote broers in het laboratorium is dat het cDNA van het 20 ul-systeem verkregen door elke inversie direct 20x wordt verdund, terwijl de postdoctorale zusters 10x worden verdund.Ik ben meestal afhankelijk van de situatie.Omdat de kwaliteit van het door elke persoon genoemde RNA anders is, is het niveau van omkering ook anders en is de omkeertechnologie mogelijk niet stabiel.
Dus elke keer dat ik het omgekeerde cDNA krijg, zal ik het eerst ongeveer 3 keer verdunnen en dan het huishoudgen gebruiken om RT-PCR uit te voeren, het aantal cycli is over het algemeen 25 cycli, om de specifieke concentratie te identificeren en vervolgens de uiteindelijke verdunningsfactor.
3 Weet je zeker dat je primers gemakkelijk te gebruiken zijn?
Het kan de smeltcurve van qRT-PCR passeren, maar dit kost nog steeds geld.Voor laboratoria zonder veel geld kunnen ze, wanneer ze veel primers krijgen, gewone RT-PCR gebruiken om te zien of het een enkele band is en om de specificiteit van de primers te identificeren.Als het laboratorium geen geld tekort komt, kan de specificiteit van alle primers een keer worden geïdentificeerd via de smeltkromme.
4 Weet u zeker dat uw experimentele omstandigheden geschikt zijn?
SYBR moet worden beschermd tegen fel licht, dus probeer het plafondlicht uit te doen wanneer u SYBR-reagens toevoegt, en u hoeft alleen gedimd licht te gebruiken om het te voltooien.
Bewaar SYBR bij 4°C.Draai tijdens gebruik voorzichtig op en neer om goed te mengen om schuimvorming te voorkomen en niet krachtig te vortexen.
Sommige jongere zusjes tekenen graag markeringen op het PCR-bord uit angst de monsters door elkaar te halen, wat niet klopt.Omdat uw markeringen zeer waarschijnlijk de verzameling van fluorescerende signalen beïnvloeden, raad ik junioren over het algemeen aan om experimentele notitieboekjes te gebruiken om te helpen bij het geheugen, zoals hieronder weergegeven.
Figuur.qRT-PCR monsterlaaddiagram
5 Weet je zeker dat je het goed doet?
Draag handschoenen, draag handschoenen, draag handschoenen en zeg drie keer belangrijke dingen.
Om de blootstelling van SYBR aan licht te verminderen, voeg ik persoonlijk graag eerst een sjabloon toe, zoals weergegeven in de onderstaande afbeelding.De ervaring leert dat de toevoeging van een kleine hoeveelheid sjabloon waarschijnlijk steekproeffouten veroorzaakt.Om de fout veroorzaakt door het toevoegen van een kleine hoeveelheid sjabloon te minimaliseren, verdubbel ik daarom meestal het monster opnieuw en verdubbel ik de hoeveelheid bij het toevoegen van het monster om de toegevoegde hoeveelheid H2O2 te verminderen.
Figuur.Schematisch diagram van het laden van qRT-PCR
Configureer vervolgens het qRT-PCR-systeem als volgt.
Figuur.qRT-PCR-systeemvoorbereidingsschema
OPMERKING: Het configuratieproces moet op ijs worden uitgevoerd.
Plak na het toevoegen van het monster de transparante afdichtingsfilm.Probeer het oppervlak van de transparante afdichtfolie niet met uw handen aan te raken, maar bedien gewoon vanuit de ruimte aan beide zijden van de folie.Omdat vingerafdrukken ook van invloed kunnen zijn op het verzamelen van fluorescerende signalen.Gebruik vervolgens een centrifuge om snel 10 s op lage snelheid te centrifugeren om te voorkomen dat het monster aan de muur hangt.
Gerelateerde producten:
Posttijd: 28 april 2023
