PCR, meerdere PCR, In-situ PCR, Omgekeerde PCR, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

We zullen de concepten, stappen en details van verschillende PCR's uitzoeken

Ⅰ. PCR

Polymerasekettingreactie, ook wel PCR genoemd, is een moleculair biologische technologie die wordt gebruikt om specifieke DNA-fragmenten te vergroten.Het kan worden beschouwd als een speciale DNA-replicatie in vitro.DNA-polymerase (DNA-polymerase I) werd al in 1955 ontdekt, en Klenow-fragment van E. Coli, dat experimentele waarde en bruikbaarheid heeft, werd begin jaren zeventig ontdekt door Dr. H. Klenow, maar omdat dit enzym geen temperatuur verdraagt, hoge temperatuur kan het degenereren, dus het voldoet niet aan de polymerasekettingreactie met degeneratie bij hoge temperatuur.De enzymen die tegenwoordig worden gebruikt (Taq-polymerase genaamd), werden in 1976 geïsoleerd uit Thermus aquaticus, een hete bronbacterie. Het kenmerk is dat het bestand is tegen hoge temperaturen en een ideaal enzym is, maar het wordt veel gebruikt na de jaren tachtig.Het oorspronkelijke concept van het oorspronkelijke primitieve prototype van PCR is vergelijkbaar met genreparatie en -kopie, dat in 1971 werd voorgesteld door Dr. KJell Kleppe. Hij publiceerde de eerste eenvoudige en kortdurende genkopie (vergelijkbaar met de eerste twee cyclusreacties van PCR).De vandaag ontwikkelde PCR is ontwikkeld door Dr. Kary B. Mullis in 1983. Dr. Mullis diende dat jaar PE-bedrijven, dus PE heeft een speciale status in de PCR-industrie.Dr. Mullis publiceerde samen met Saiki en anderen in 1985 officieel het eerste verwante artikel. Sindsdien wordt PCR duizenden kilometers per dag gebruikt, en men kan zeggen dat de kwaliteit van verwante artikelen vele andere onderzoeksmethoden onsmakelijk maakt.Vervolgens wordt PCR-technologie veel gebruikt in biologisch wetenschappelijk onderzoek en klinische toepassingen, en wordt het de belangrijkste technologie van moleculair biologisch onderzoek.Mullis won ook de Nobelprijs voor scheikunde in 1993.

PCRBeginsel

Het basisprincipe van PCR-technologie is vergelijkbaar met het natuurlijke replicatieproces van DNA, en de specificiteit hangt af van de oligonucleotideprimer die complementair is aan beide uiteinden van de doelsequentie.PCR bestaat uit degeneratie-hybride-uitbreiding van drie basisreactiestappen: ①Degeneratie van template-DNA: Nadat het template-DNA gedurende een bepaalde tijd is verwarmd tot ongeveer 93°C, wordt de dual-DNA-oplossing voor het dual-chain DNA gevormd door de PCR-amplificatie van het template-DNA Leaving, maak er een enkele keten van zodat het kan worden gecombineerd met de primer ter voorbereiding op de volgende reactieronde.②Het uitgloeien (verbinding) van het template-DNA en de primer: Nadat het template-DNA is verhit en gedegenereerd tot een enkele keten, daalt de temperatuur tot ongeveer 55°C.De complementaire sequentie van de primer en de enkele keten van het matrijs-DNA.③De uitbreiding van de primer: DNA-template - de binding van de primer is gebaseerd op de werking van TaqDNA-polymerase, met dNTP als grondstof voor de reactie.Behoud het principe van replicatie, synthetiseer een nieuwe semi-gereserveerde kopieketen die de sjabloon-DNA-keten aanvult, en herhaal cyclus degeneratie-gloeien-verlenging drie processen kunnen meer "semi-gereserveerde kopieketen" krijgen, en deze nieuwe ketting is weer beschikbaar Word een sjabloon voor de volgende cyclus.Het duurt 2-4 minuten om de lus te voltooien, het doelgen kan in 2-3 uur enkele miljoenen keren worden geamplificeerd.

StandaardPCRReactie systeem

Vijf elementen van PCR-reactie

Er zijn hoofdzakelijk vijf soorten stoffen die betrokken zijn bij de PCR-reactie, namelijk primer, enzym, dNTP, template en buffer (Mg2+ is vereist).[PCR-procedure]

Het standaard PCR-proces is verdeeld in drie stappen

1. DNA-degeneratie (90°C-96°C): DNA-templates met twee ketens onder thermische actie, waterstofbruggen breken en vormen een enkelketenig DNA.

2. Gloeien (25℃ -65℃): De systeemtemperatuur wordt verlaagd, de primer wordt gecombineerd met de DNA-template om een ​​lokale dual-chain te vormen.

3. Uitbreiding (70 ℃ -75 ℃): onder invloed van Taq-enzym (ongeveer 72 ° C, de beste activiteit), wordt dNTP gebruikt als grondstof, strekt zich uit vanaf het 5'-uiteinde van de primer → 3'-uiteinde, synthese en sjabloon vullen elkaar DNA-keten aan.

Elke cyclus wordt gedenatureerd, gegloeid en verlengd, waardoor het DNA-gehalte wordt verdubbeld.Vanwege het korte amplificatiegebied kan momenteel enige PCR in zeer korte tijd worden gerepliceerd, zelfs als de Taq-enzymactiviteit niet optimaal is, dus kan deze worden gewijzigd in twee stappen, dat wil zeggen dat de annealing en extensie tegelijkertijd kunnen worden uitgevoerd bij 60°C-65°C.Om het proces van heffen en koelen te verminderen en de reactiesnelheid te verbeteren.

PCR-reactiefuncties

● Hoge specificiteit

De specifieke doorslaggevende factoren van de PCR-respons zijn: ①De specifieke combinatie van de primer en het template-DNA.②Het principe van basenparing.③De loyaliteit van de TaqDNA-polymerasesynthesereactie.④De specificiteit en conservativiteit van het doelgen.

De juiste combinatie van primers en sjablonen is de sleutel.De binding van de primer en de template en de verlenging van de primerketen zijn gebaseerd op het principe van alkalische base-matching.De loyaliteit van polymerasesynthesereacties en de hoge temperatuurbestendigheid van de Taq DNA-polymerase om de binding (verbinding) van de matrijs en primer in de reactie te maken, kan bij een hogere temperatuur worden uitgevoerd.De specificiteit van de combinatie wordt sterk vergroot.De clip kan een hoge mate van correctheid behouden.Door een genetisch doelgebied te selecteren met een hoge conservativiteit en een hoge conservativiteit, is de specificiteit ervan hoger.

● Hoge gevoeligheid

Het productievolume van PCR-producten wordt verhoogd met een index, waardoor het startsjabloon van Picker (PG=10-12) kan worden uitgebreid om het niveau van de microcontroller te verhogen tot het niveau van microgrammen (μg= -6).Een doelcel kan worden gedetecteerd vanaf 1 miljoen cellen;bij de detectie van virussen kan de gevoeligheid van PCR 3 RFU's (lege vlekken gevormde eenheden) bereiken;het minimale detectiepercentage in de bacteriewetenschap is 3 bacteriën.

● Eenvoudig en snel

De PCR-reflectie maakt gebruik van een Taq-DNA-polymerase op hoge temperatuur, die de reactieoplossing in één keer toevoegt, dat wil zeggen een degeneratie-hybride-extensiereactie op de DNA-amplificatie-oplossing en de waterbadpot.Over het algemeen is de amplificatiereactie in 2 tot 4 uur voltooid.Augmented-producten worden over het algemeen geanalyseerd met een elektrisch zwaard en hoeven geen isotopen, geen radioactieve vervuiling en gemakkelijke promotie te gebruiken.

● De zuiverheid van het monster is laag

Het is niet nodig om virussen of bacteriën en kweekcellen van elkaar te scheiden.Ruwe DNA-producten en RNA kunnen als versterkers worden gebruikt.Detectie van DNA-amplificatie kan direct worden gebruikt met behulp van klinische monsters zoals bloed, lichaamsvloeistof, hoestwasvloeistof, haar, cellen en levend weefsel.

PCRveel voorkomende problemen

● Vals negatief, geen versterkte banden

De belangrijkste stadia van de PCR-reactie omvatten: ① bereiding van template-nucleïnezuren, ② kwaliteit en specificiteit van primers, ③ de kwaliteit van enzymen ④ PCR-cyclusomstandigheden.Het vinden van de reden moet ook worden geanalyseerd en bestudeerd voor de bovenstaande links.

Sjablonen: ① Het sjabloon bevat diverse eiwitten, ② Het sjabloon bevat een Taq-enzymremmer, ③ Het eiwit in het sjabloon wordt niet geëlimineerd, vooral het groepseiwit in het chromosoom.⑤ Degeneratie van nucleïnezuur door deminer is niet grondig.Wanneer de kwaliteit van enzymen en primers goed is, is er geen versterkingsband, wat hoogstwaarschijnlijk de spijsverteringsbehandeling van monsters is.Er is iets mis met het sjabloon-nucleïnezuur-extractieproces, dus om een ​​effectieve en stabiele verteringsoplossing te bereiden, moet de procedure worden vastgelegd en niet willekeurig worden gewijzigd.

Enzyminactivatie: een nieuw enzym of zowel oude als nieuwe enzymen moeten samen worden gebruikt om te analyseren of de enzymactiviteit verloren of onvoldoende is, wat leidt tot fout-negatieven.Opgemerkt moet worden dat Taq-enzym of ethidiumbromide soms wordt vergeten.

Primer: de kwaliteit van de primer, de concentratie van de primer en of de concentratie van de twee primers symmetrisch is.Het is een veel voorkomende reden voor het mislukken van de PCR of de toenemende band is niet ideaal en vatbaar voor diffusie.Er zijn problemen met de kwaliteit van de primers van sommige batchnummers.De twee primers hebben een hoge concentratie en een lage concentratie, waardoor asymmetrische amplificatie met lage efficiëntie wordt veroorzaakt.De tegenmaatregelen zijn: ① Selecteer een goede primer om eenheden te synthetiseren.② De concentratie van de primer hangt niet alleen af ​​van de OD-waarde, maar besteedt ook aandacht aan de oorspronkelijke vloeistof van de primer om agar-suikergelelektroforese te maken.Er moet een primerstripzone zijn en de helderheid van de twee primers moet over het algemeen consistent zijn.Riem, PCR kan op dit moment mislukken en moet worden opgelost met de primersynthese-eenheid.Als een primer hoog is, is de helderheid laag en moet de concentratie bij verdunning in evenwicht zijn.③ De primer moet in een hoge concentratie worden betaald en bewaard om te voorkomen dat onderdelen van de koelkast meerdere keren bevriezen of langdurig worden gekoeld, waardoor de primer zal verslechteren en degraderen.④ Het ontwerp van de primer is onredelijk, zoals de lengte van de primer is onvoldoende en de di-cluster wordt gevormd tussen de primers.

Mg2+concentratie: Mg2+ionconcentratie heeft een grote invloed op de efficiëntie van de PCR-amplificatie.Overmatige concentratie kan het andere geslacht van PCR-amplificatie verminderen.Als de concentratie te laag is, zal de PCR-amplificatie-output zelfs de PCR-amplificatie doen mislukken zonder de expansieband.

Verandering van reactievolume: het volume dat wordt gebruikt bij PCR-amplificatie is 20ul, 30ul en 50ul of 100uL, het grote volume van de toepassing voor PCR-amplificatie wordt ingesteld op basis van verschillende doeleinden van wetenschappelijk onderzoek en klinische testen.Na het maken van kleine volumes zoals 20ul, is het noodzakelijk om een ​​koordconditie te maken bij het maken van de maat, anders zal het mislukken.

Fysieke redenen: Transformatie is erg belangrijk voor PCR-amplificatie.Als de degeneratietemperatuur laag is, is de degeneratietijd kort en treedt deze waarschijnlijk op in fout-negatieven;een te lage gloeitemperatuur kan niet-specifieke amplificatie veroorzaken en de specifieke amplificatie-efficiëntie verminderen.Sterke invloed op de combinatie van primers en sjablonen om de efficiëntie van de PCR-amplificatie te verminderen.Soms is het nodig om standaardthermometers te gebruiken om de variabiliteit, uitgloeiing en verlengde temperatuur in de extensie of in water oplosbare kookpan te detecteren, wat een van de redenen is voor het mislukken van de PCR.

Varianten van doelsequenties: als de doelsequentie voorkomt, een mutatie of deletie, de combinatie van het prototype en de matrijs wordt gecombineerd, of als gevolg van het ontbreken van een doelsequentie, zullen de primer en de matrijs de complementaire sequentie verliezen en zal de PCR-amplificatie niet succesvol zijn.

● Vals positief

De PCR-amplificatieband lijkt consistent met de doelsequentieband, en soms is de band netter en hoger.

Primerontwerp is niet geschikt: de geselecteerde amplificatiesequentie en niet-doelgerichte amplificatiesequentie zijn homoloog, dus bij PCR-amplificatie zijn de geamplificeerde PCR-producten niet-doelgerichte sequenties.De doelsequentie is te kort of de primer is te kort en is vatbaar voor vals-positieven.Moet opnieuw worden ontworpen.

Kruisverontreiniging van doelsequentie of amplificatieproducten: Er zijn twee redenen voor deze vervuiling: ten eerste kruisverontreiniging van het gehele genoom of grote segmenten, wat leidt tot valse positieven.Dit soort vals-positieven kan op de volgende manieren worden opgelost: Wees voorzichtig en voorzichtig tijdens het gebruik om te voorkomen dat de doelsequentie wordt ingeademd in het monsterpistool of uit de centrifugaalbuis spat.Behalve enzymen en stoffen die niet bestand zijn tegen hoge temperaturen, moeten alle reagentia of apparatuur onder hoge druk worden gedesinfecteerd.De centrifugale pijpen en monsters moeten in één keer worden gebruikt.Indien nodig worden de reageerbuis en het reagens, voordat monsters worden toegevoegd, blootgesteld aan ultraviolette stralen om het bestaande nucleïnezuur te vernietigen.Ten tweede, kleine fragmenten in de luchtverontreiniging.Deze kleine fragmenten zijn korter dan de doelwitsequentie, maar ze hebben een bepaalde homologie.Het kan met elkaar worden gesplitst.Na het aanvullen van de primers kan het PCR-product worden geëxpandeerd, wat zal leiden tot fout-positieve productie.Het kan worden gebruikt om de nest-PCR-methode te verminderen of te elimineren.

● Verschijnen niet-specifieke versterkingsband

De banden die verschenen na PCR-amplificatie komen niet overeen met de verwachte grootte, of zijn groot of klein, of tegelijkertijd of tegelijkertijd specifieke amplificatiebanden en niet-specifieke amplificatiebanden.De opkomst van niet-specifieke banden is: Ten eerste zijn de primers onvolledig complementair aan de doelsequentie, of de polymerisatie van de primer om een ​​di-cluster te vormen.De tweede is dat de concentratie van MG2+ionen te hoog is, de annealingstemperatuur te laag is en dat het aantal PCR-cycli gerelateerd is.Ten tweede de kwaliteit en hoeveelheid enzymen.Vaak zijn enzymen van sommige bronnen vatbaar voor niet-speciale banden en komen de enzymen van de andere bron niet voor.Soms treedt ook niet-specifieke amplificatie van enzymen op.De tegenmaatregelen zijn: herontworpen aantrekkelijks indien nodig.Verminder de hoeveelheid enzym of vervang het enzym van een andere bron.Verminder de hoeveelheid primair, verhoog het aantal sjablonen op de juiste manier en verminder het aantal cycli.Verhoog de uitgloeitemperatuur op de juiste manier of gebruik de methode met twee temperatuurpunten (93°C degeneratie, uitgloeien en verlengen bij ongeveer 65°C).

● Verschijnen schilferige kabel of smeertape

PCR-amplificatie lijkt soms te worden aangebracht of omhuld of tapijtachtige riem.Vanwege de overmatige hoeveelheid enzymen of de slechte kwaliteit van het enzym is de dNTP-concentratie te hoog, de Mg2+-concentratie te hoog, de annealingstemperatuur te laag en het aantal cycli te hoog.De tegenmaatregelen zijn: ①Verminder de hoeveelheid enzymen, of verander het enzym van een andere bron.②Verminder de concentratie van dNTP ③Verlaag de Mg2+-concentratie op de juiste manier.④Verhoog het aantal sjablonen en verminder het aantal cycli.

gerelateerde producten

PCR Heroᵀᴹ (met kleurstof)

◮ Hogere getrouwheid: 6 keer die van gewoon Taq-enzym;

◮ Snellere versterkingssnelheid

◮ Meer aanpassingsvermogen aan sjablonen

◮ Hogere versterkingsefficiëntie

◮ Omgevingstolerantie is sterker: geplaatst bij 37°C gedurende een week, met behoud van meer dan 90% activiteit;

◮ Het heeft 5'→3' DNA-polymeraseactiviteit en 5'→3' exonucleaseactiviteit, zonder 3'→5' exonucleaseactiviteit.

PCR Easyᵀᴹ (met kleurstof)

Het unieke reactiesysteem en de zeer efficiënte Taq DNA-polymerase zorgen ervoor dat de PCR-reactie een hogere amplificatie-efficiëntie, specificiteit en gevoeligheid heeft.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Groen I

◮ One-step kit maakt reverse transcriptie en qPCR twee reacties in dezelfde buis, hoeft alleen template-RNA, specifieke PCR-primers en RNase-Free ddH toe te voegen₂O.

◮ De kit kan viraal RNA of sporen-RNA snel en efficiënt kwantitatief analyseren.

◮ De kit maakt gebruik van een uniek Foregene reverse transcriptiereagens en Foregene HotStar Taq DNA-polymerase gecombineerd met een uniek reactiesysteem om de amplificatie-efficiëntie en specificiteit van de reactie effectief te verbeteren.

◮ Het geoptimaliseerde reactiesysteem zorgt ervoor dat de reactie een hogere detectiegevoeligheid, sterkere thermische stabiliteit en betere tolerantie heeft.

◮ RT-qPCR Eenvoudig^TM(One Step)-SYBR Green I-kit wordt geleverd met ROX interne referentiekleurstof, die kan worden gebruikt om signaalachtergrond en signaalfouten tussen putjes te elimineren, wat handig is voor klanten om te gebruiken in verschillende modellen van kwantitatieve PCR-instrumenten.

RT Gemakkelijk^TMII (Masterpremix voor eerste streng cDNA-synthese voorreal-time PCR)

- Efficiënt vermogen om gDNA te verwijderen, dat binnen 2 minuten gDNA in de sjabloon kan verwijderen.

- Efficiënt reverse transcriptiesysteem, het duurt slechts 15 minuten om de synthese van de eerste cDNA-streng te voltooien.

-Complexe sjablonen: sjablonen met een hoog GC-gehalte en een complexe secundaire structuur kunnen ook met hoge efficiëntie worden omgekeerd.

- Zeer gevoelig reverse transcriptiesysteem, sjablonen op pg-niveau kunnen ook cDNA van hoge kwaliteit krijgen.

-Het reverse transcriptiesysteem heeft een hoge thermische stabiliteit, de optimale reactietemperatuur is 42 ℃ en het heeft nog steeds goede reverse transcriptieprestaties bij 50 ℃.