Hoeveel weet je

Over Nucleïnezuur extractie

Het begin en einde van gezuiverd nucleïnezuur

Alles is in het begin moeilijk, gezuiverd nucleïnezuur is het moeilijkst

Initiatie van moleculaire experimenten, voor latere experimenten

Succes of falen heeft een cruciale impact.

Trace/ultra-trace UV-spectrofotometer geniet de voorkeur van veel wetenschappelijke onderzoekers omdat het de nucleïnezuurconcentratie en eiwit- en zoutionresiduen eenvoudig, snel en economisch kan detecteren.

Zoals we allemaal weten, betekent A260 nucleïnezuurabsorptie OD-waarde, A280 betekent eiwitconcentratie absorptie OD-waarde, A230 betekent zoutionenconcentratie absorptie OD-waarde, dus A260 kan nucleïnezuurconcentratie omzetten, A260/280 betekent eiwitresidu, A260/230 betekent zoutionresidu, maar dit is slechts een regel ontdekt door onderzoekers op basis van een groot aantal meetresultaten, en het is ”conventioneel' te geloven dat het de zuiverheid van DNA en RNA kan verklareneen zekere mate.Het is niet de enige standaard voor de identificatie van nucleïnezuuropbrengst en -zuiverheid, het wordt alleen gebruikt als referentie en het is geen "gouden standaard".

De Thermo Fisher ND-2000 handleiding benadrukt de betrouwbaarheid van de testresultaten

De reden is dat de resultaten die worden verkregen door een micro/ultramicro UV-spectrofotometer te gebruiken alleen de opbrengst en zuiverheid van nucleïnezuur vanaf de zijkant weergeven, en er zijn veel factoren die van invloed zijn (optisch pad, monstervolume, monsterconcentratie, pH-waarde, andere ionen die de absorptiemeting beïnvloeden, enz.), de gemeten OD-waarde is niet noodzakelijkerwijs nauwkeurig.Tegelijkertijd hebben enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA, RNA, dNTP's en sommige eiwitten, vanwege het gebrek aan specificiteit van het absorptiewaardebepalingsmateriaal, allemaal absorptiepieken bij een golflengte van 260 nm, en de concentratie bepaald door alleen A260 is niet noodzakelijkerwijs het echte DNA of RNA.Concentratie en de integriteit en degradatie ervan kunnen niet worden beoordeeld.

Dus hoe de kwaliteit van ons gezuiverde nucleïnezuur te beoordelen?Naast het gebruik van een micro/ultramicro UV-spectrofotometer voor detectie, zijn ook methoden zoals agarosegelelektroforese vereist om de zuiverheid en integriteit van het nucleïnezuur visueel weer te geven en om de concentratie tot op zekere hoogte aan te geven.Op deze manier zijn de nucleïnezuuropbrengst en zuiverheid verkregen uit de detectieresultaten van verschillende methoden geloofwaardig.

Experimentele grafiekvergelijking

Genomisch DNA van H1299-cellen werd geëxtraheerd met behulp van de DNA-extractiekits van bedrijf A en er werd een significante onzuiverheidsverontreiniging waargenomen, resulterend in hoge OD-waarden

(OD-meetwaarde en bijbehorend elektroferogram)

Evaluatie-index

Bestaat er een "gouden standaard" voor nucleïnezuuropbrengst en kwaliteitstesten?

Voor zover wij weten, bestaat er geen eenvoudige, snelle en goedkope methode.Of het nu een spectrofotometer, gelelektroforese of massaspectrometrie is, ze weerspiegelen allemaal de concentratie en zuiverheid van nucleïnezuur in de oplossing vanuit verschillende aspecten, en ze moeten worden beoordeeld door naar elkaar te verwijzen.

De beste evaluatie-index is altijdde vervolgexperimentele toepassing.Het heeft geen invloed op de efficiëntie van reverse transcriptie en PCR-amplificatie.Het verkrijgen van betrouwbare amplificatieproducten en Ct-waarden, en het verkrijgen van een volledige sequentie door sequentiëring is succesvolle nucleïnezuurextractie.

Samengevat, de opvatting van de alleen-verhoudingstheorie zou moeten worden uitgedaagd door de opvatting van "het gebruik van goede stroomafwaartse experimentele resultaten als goede extractieparameters"!

Aanbevolen Foregene DNA-RNA-extractiekits om een ​​hoge DNA/RNA-zuiverheid te verkrijgen:

https://www.foreivd.com/reagent/dna-isolation-series/

https://www.foreivd.com/reagent/rna-isolation-series/