Realtime PCR, ook wel kwantitatieve PCR of qPCR genoemd, is een methode voor real-time monitoring en analyse van PCR-amplificatieproducten.
Omdat kwantitatieve PCR de voordelen heeft van eenvoudige bediening, snel en handig, hoge gevoeligheid, goede herhaalbaarheid en lage besmettingsgraad, wordt het veel gebruikt bij medische tests, beoordeling van de werkzaamheid van geneesmiddelen, onderzoek naar genexpressie, transgeen onderzoek, gendetectie, detectie van pathogenen, detectie van dieren en planten., voedsel testen en andere velden.
Daarom, of u nu bezig bent met fundamenteel onderzoek in de biowetenschappen, of werknemers van farmaceutische bedrijven, veeteeltbedrijven, voedingsbedrijven of zelfs werknemers van inspectie- en quarantainebureaus, milieubewakingsafdelingen, ziekenhuizen en andere eenheden, u zult min of meer worden blootgesteld aan of u moet de kennis hebben van het beheersen van kwantitatieve PCR.

Principe van real-time PCR

Realtime PCR is een methode waarbij fluorescerende stoffen aan het PCR-reactiesysteem worden toegevoegd en de fluorescentiesignaalintensiteit tijdens het PCR-reactieproces in realtime wordt gecontroleerd door een kwantitatief PCR-instrument, en ten slotte worden de experimentele gegevens geanalyseerd en verwerkt.

【Versterkingscurve】is de curve die het dynamische proces van PCR beschrijft.De amplificatiecurve van PCR is eigenlijk geen standaard exponentiële curve, maar een sigmoïde curve.

[Platformfase van versterkingscurve]Met de toename van het aantal PCR-cycli, de inactivatie van DNA-polymerase, de uitputting van dNTP's en primers, en de remming van de synthesereactie door het reactiebijproduct pyrofosfaat, enz., groeit de PCR niet altijd exponentieel., en zal uiteindelijk een plateau betreden.

[Exponentieel groeigebied van versterkingscurve]Hoewel de plateaufase sterk varieert, is de herhaalbaarheid in een bepaald gebied van het exponentiële groeigebied van de amplificatiecurve erg goed, wat erg belangrijk is voor kwantitatieve analyse van PCR.

[Drempelwaarde en Ct-waarde]We stellen de grenswaarde van fluorescentiedetectie op de juiste positie in het exponentiële groeigebied van de amplificatiecurve, namelijk de drempelwaarde (Threshold).Het snijpunt van de drempelwaarde en de amplificatiecurve is de Ct-waarde, dat wil zeggen dat de Ct-waarde verwijst naar het aantal cycli (Threshold Cycle) wanneer de drempelwaarde wordt bereikt.

Onderstaande grafiek toont duidelijk de relatie tussen drempellijn en amplificatiecurve, drempel en Ct-waarde.

【Hoe te kwantificeren?】

Door de wiskundige theorie is bewezen dat de Ct-waarde een omgekeerde lineaire relatie heeft met de logaritme van het aantal initiële sjablonen.Realtime PCR bewaakt PCR-amplificatieproducten in realtime en kwantificeert ze tijdens de exponentiële amplificatiefase.

Voor elke PCR-cyclus nam het DNA exponentieel toe met 2 keer, en bereikte al snel een plateau.

Ervan uitgaande dat de hoeveelheid uitgangs-DNA A is₀ , na n cycli kan de theoretische hoeveelheid DNA-product worden uitgedrukt als:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Hoe groter de initiële DNA-hoeveelheid Ao is, hoe eerder de hoeveelheid van het geamplificeerde product de detectiewaarde An bereikt, en het aantal cycli bij het bereiken van An is de Ct-waarde.Dat wil zeggen, hoe groter de initiële DNA-hoeveelheid A 0 is, hoe eerder de amplificatiecurve piekt, en hoe overeenkomstig het vereiste aantal cycli n kleiner is.

We voeren gradiëntverdunning uit van de standaard met bekende concentratie en gebruiken deze als een sjabloon voor real-time PCR, en een reeks amplificatiecurven zal worden verkregen met gelijke tussenpozen in de volgorde van de start-DNA-hoeveelheid van meer naar minder.Volgens de lineaire relatie tussen de Ct-waarde en de logaritme van het aantal startsjablonen, a[standaardcurve] kan worden gemaakt.

Door de Ct-waarde van het monster met een onbekende concentratie in de standaardcurve te vervangen, kan de initiële sjabloonhoeveelheid van het monster met onbekende concentratie worden verkregen, wat het kwantitatieve principe is van real-time PCR.

Detectiemethode van real-time PCR

Realtime PCR detecteert PCR-amplificatieproducten door de fluorescentie-intensiteit in het reactiesysteem te detecteren.

Principe van de methode voor het inbedden van fluorescerende kleurstoffen】

Fluorescerende kleurstoffen, zoals TB Green ® , kan niet-specifiek binden aan dubbelstrengig DNA in PCR-systemen en fluoresceren bij binding.

De fluorescentie-intensiteit in het reactiesysteem nam exponentieel toe met de toename van PCR-cycli.Door de fluorescentie-intensiteit te detecteren, kan de hoeveelheid DNA-amplificatie in het reactiesysteem in real time worden gevolgd, en vervolgens kan de hoeveelheid van de uitgangstemplate in het monster omgekeerd worden geschat.

【Principe van de fluorescerende sondemethode】

fluorescerende sondeis een nucleïnezuursequentie met een fluorescerende groep aan het 5'-uiteinde en een dovende groep aan het 3'-uiteinde, die specifiek aan de matrijs kan binden.Wanneer de sonde intact is, wordt de door de fluorofoor uitgezonden fluorescentie uitgedoofd door de uitdovingsgroep en kan deze niet fluoresceren.Wanneer de sonde wordt afgebroken, zal de fluorescerende stof dissociëren en fluorescentie uitzenden.

Een fluorescerende sonde wordt aan de PCR-reactieoplossing toegevoegd.Tijdens het uitgloeiproces zal de fluorescerende sonde zich binden aan de specifieke positie van de sjabloon.Tijdens het verlengingsproces kan de 5'→3'-exonuclease-activiteit van het PCR-enzym de fluorescerende sonde ontleden die is gehybridiseerd met de matrijs, en de fluorescerende stof wordt gedissocieerd om fluorescentie uit te stralen.Door de fluorescentie-intensiteit van de sonde in het reactiesysteem te detecteren, kan het doel van het bewaken van de amplificatiehoeveelheid van het PCR-product worden bereikt.

【Selectie van fluorescentiedetectiemethode】

Als het wordt gebruikt om sequenties met hoge homologie te onderscheiden en multiplex PCR-detectie uit te voeren, zoals SNP-typeringsanalyse, is de fluorescerende sondemethode onvervangbaar.
Voor andere real-time PCR-experimenten kan een eenvoudige, gemakkelijke en goedkope fluorescerende chimaera-methode worden gebruikt.

probesSterke specificiteit, geschikt voor multiplex PCR

Tekortkoming

Hoge specificiteitseisen voor amplificatie;

multiplex PCR kan niet worden uitgevoerd Noodzaak om specifieke sondes te ontwerpen, hoge kosten;

soms is het ontwerp van de sonde moeilijk

Gerelateerde producten: