Ct-waarde is de belangrijkste resultaatpresentatievorm van fluorescerende kwantitatieve PCR.Het wordt gebruikt om verschillen in genexpressie of het aantal genkopieën te berekenen.Dus wat wordt de Ct-waarde van fluorescentiekwantificering als redelijk beschouwd?Hoe het effectieve bereik van de Ct-waarde te waarborgen?
Wat is Ct-waarde?
Tijdens het qPCR-amplificatieproces, het overeenkomstige aantal amplificatiecycli (Cycle Threshold) wanneer het fluorescentiesignaal van het geamplificeerde product de ingestelde fluorescentiedrempel bereikt.C staat voor Cycle en T staat voor Threshold.Simpel gezegd, de Ct-waarde is het aantal cycli dat overeenkomt met het moment waarop de initiële sjabloonamplificatie een bepaalde hoeveelheid product bereikt in qPCR.De zogenaamde "een bepaalde hoeveelheid product" wordt later verder uitgelegd.
Wat doet de Ct-waarde?
1.Relatie tussen exponentiële versterking, sjabloonhoeveelheid en Ct-waarde
Idealiter worden genen in qPCR geaccumuleerd door exponentiële amplificatie na een bepaald aantal cycli.De relatie tussen het aantal amplificatiecycli en de hoeveelheid producten is: Hoeveelheid geamplificeerd product = initiële sjabloonhoeveelheid × (1+En) aantal cycli.De qPCR-reactie is echter niet altijd in een ideale situatie.Wanneer de hoeveelheid geamplificeerd product een "bepaalde producthoeveelheid" bereikt, is het aantal cycli op dit moment de Ct-waarde en bevindt het zich in de exponentiële amplificatieperiode.De relatie tussen de Ct-waarde en de hoeveelheid starttemplate: Er is een lineair verband tussen de Ct-waarde van de template en de logaritme van het startkopienummer van de template.Hoe hoger de initiële templateconcentratie, hoe kleiner de Ct-waarde;hoe lager de initiële templateconcentratie, hoe hoger de Ct-waarde.
2. Amplificatiecurve, fluorescentiedrempel en bepaalde PCR-producthoeveelheid
De hoeveelheid qPCR-amplificatieproduct wordt direct gepresenteerd in de vorm van een fluorescerend signaal, dat wil zeggen de amplificatiecurve.In het vroege stadium van PCR is de amplificatie onder ideale omstandigheden, is het aantal cycli klein, is de productaccumulatie klein en kan het fluorescentieniveau niet duidelijk worden onderscheiden van de fluorescentieachtergrond.Daarna neemt de fluorescentie toe en gaat de exponentiële fase in.De hoeveelheid PCR-product kan op een bepaald moment worden gedetecteerd wanneer de PCR-reactie zich net in de exponentiële fase bevindt, wat kan worden gebruikt als "een bepaalde hoeveelheid product", en de initiële inhoud van het sjabloon kan hieruit worden afgeleid.Daarom is de fluorescentiesignaalintensiteit die overeenkomt met een bepaalde hoeveelheid product de fluorescentiedrempel.
In het late stadium van PCR vertoont de amplificatiecurve niet langer exponentiële amplificatie en gaat de lineaire fase en plateaufase in.
3. Reproduceerbaarheid van Ct-waarden
Wanneer de PCR-cyclus het cyclusnummer van de Ct-waarde bereikt, is deze net de werkelijke exponentiële amplificatieperiode ingegaan.Op dit moment is de kleine fout niet versterkt, dus de reproduceerbaarheid van de Ct-waarde is uitstekend, dat wil zeggen dat hetzelfde sjabloon op verschillende tijdstippen of in verschillende buizen tegelijkertijd wordt versterkt.Amplificatie, de verkregen Ct-waarde is constant.
1.Versterkingsefficiëntie En
PCR-amplificatie-efficiëntie verwijst naar de efficiëntie waarmee de polymerase het te amplificeren gen omzet in een amplicon.De amplificatie-efficiëntie wanneer één DNA-molecuul wordt getransformeerd in twee DNA-moleculen is 100%.Versterkingsefficiëntie wordt gewoonlijk uitgedrukt als En.Om de analyse van volgende artikelen te vergemakkelijken, worden de factoren die van invloed zijn op de versterkingsefficiëntie kort geïntroduceerd.
| Beïnvloedende factoren | uitleg | Hoe te oordelen? |
| A. PCR-remmers | 1. Het template-DNA bevat stoffen die de PCR-reactie remmen, zoals eiwitten of detergentia.2. Het cDNA na reverse transcriptie bevat een hoge concentratie template-RNA of RT-reagenscomponenten, die ook de daaropvolgende PCR-reactie kunnen remmen. | 1. Of er sprake is van vervuiling kan worden beoordeeld door de verhouding A260/A280 en A260/A230 of RNA-elektroforese te meten.2. Of het cDNA na reverse transcriptie volgens een bepaalde verhouding wordt verdund. |
| B. Onjuist primerontwerp | Primers gloeien niet efficiënt | Controleer primers op primerdimeren of haarspelden, mismatches en soms overspannende intronische ontwerpen. |
| C. Onjuist ontwerp van het PCR-reactieprogramma | 1. Primers kunnen niet effectief uitharden2. Onvoldoende afgifte van DNA-polymerase 3. Langdurige DNA-polymerase-activiteit bij hoge temperatuur nam af | 1. De gloeitemperatuur is hoger dan de TM-waarde van de primer2. Pre-denaturatietijd is te kort 3. De tijd van elke stap van de reactieprocedure is te lang |
| D. Onvoldoende mengen van reagentia of pipetteerfouten | In het reactiesysteem is de lokale concentratie van PCR-reactiecomponenten te hoog of ongelijkmatig, wat resulteert in niet-exponentiële amplificatie van PCR-amplificatie | |
| E. Amplicon-lengte | De lengte van het amplicon is te lang, meer dan 300 bp, en de versterkingsefficiëntie is laag | Controleer of de lengte van het amplicon tussen 80 en 300 bp ligt |
| F. Invloed van qPCR-reagentia | De concentratie van DNA-polymerase in het reagens is laag of de concentratie van ionen in de buffer is niet geoptimaliseerd, waardoor de Taq-enzymactiviteit niet het maximum bereikt | Bepaling van de versterkingsefficiëntie door middel van een standaardcurve |
2. Bereik van Ct-waarden
Ct-waarden variëren van 15-35.Als de Ct-waarde lager is dan 15, wordt aangenomen dat de amplificatie binnen het bereik van de basislijnperiode valt en dat de fluorescentiedrempel niet is bereikt.In het ideale geval is er een lineair verband tussen de Ct-waarde en de logaritme van het oorspronkelijke aantal kopieën van de sjabloon, dat wil zeggen de standaardcurve.Volgens de standaardcurve, wanneer de amplificatie-efficiëntie 100% is, is de berekende Ct-waarde voor het kwantificeren van het aantal enkele kopieën van het gen ongeveer 35. Als het groter is dan 35, is het initiële aantal kopieën van de sjabloon theoretisch minder dan 1, wat als zinloos kan worden beschouwd.
Voor verschillende gen-Ct-bereiken is het vanwege het verschil in het aantal genkopieën en de amplificatie-efficiëntie in de initiële matrijshoeveelheid noodzakelijk om een standaardkromme voor het gen te maken en het lineaire detectiebereik van het gen te berekenen.
3. Beïnvloedende factoren van de Ct-waarde
Uit de relatie tussen het aantal amplificatiecycli en de hoeveelheid product: hoeveelheid geamplificeerd product = hoeveelheid initiële template × (1+En) cyclusnummer, kan worden gezien dat onder ideale omstandigheden de hoeveelheid initiële template en En een negatieve invloed op de Ct-waarde zal hebben.Het verschil in sjabloonkwaliteit of versterkingsefficiëntie zal ervoor zorgen dat de Ct-waarde te groot of te klein is.
4.Ct-waarde is te groot of te klein
Posttijd: 22 februari 2023
