Het opvallende kenmerk van de PCR-reactie is de grote versterkingscapaciteit en de extreem hoge gevoeligheid.Om de PCR-prestaties en detectie-efficiëntie te verbeteren, zetten we ons in om de PCR-amplificatiecapaciteit en detectiegevoeligheid te verbeteren, maar de hoofdpijn zit in het proces van het experiment.Vals-positieven komen vaak voor, en een zeer kleine hoeveelheid kruisbesmetting van monsters of PCR-productverontreiniging kan vals-positieven in het experiment veroorzaken.
Vijf soorten PCR-productverontreiniging
Er zijn veel redenen voor PCR-besmetting, die grofweg kunnen worden onderverdeeld in de volgende categorieën:
Monsterbesmetting wordt voornamelijk veroorzaakt door de besmetting van de container waarin het monster is verzameld, of wanneer het monster is geplaatst, het uit de container is gelekt vanwege een losse verzegeling, of het monster is aan de buitenkant van de container gehecht, wat kruisbesmetting veroorzaakt;Verontreiniging leidt tot besmetting tussen monsters;sommige microbiële exemplaren, vooral virussen, kunnen zich verspreiden met aerosolen of aerosolen vormen, wat resulteert in wederzijdse besmetting.
De belangrijkste reden is dat tijdens de bereiding van PCR-reagentia het monsterkanon, de container, dubbel gedestilleerd water en andere oplossingen worden verontreinigd door de PCR-nucleïnezuurtemplate.
In laboratoria voor moleculaire biologie en sommige laboratoria die gekloonde plasmiden als positieve controles gebruiken, komt het probleem van verontreiniging met gekloonde plasmiden ook vaak voor.Omdat het gehalte aan kloneringsplasmide in eenheidsvolume vrij hoog is en er meer hulpmiddelen en reagentia nodig zijn in het zuiveringsproces, en het plasmide in levende cellen zeer waarschijnlijk besmet is vanwege het sterke groei- en reproductievermogen van levende cellen.
De verontreiniging van geamplificeerde producten is het meest voorkomende verontreinigingsprobleem bij PCR-reacties.Omdat de kopieerhoeveelheid van het PCR-product groot is (meestal 1013 kopieën/ml), wat veel hoger is dan de limiet van het aantal PCR-detectiekopieën, kan een zeer kleine hoeveelheid PCR-productverontreiniging valse positieven veroorzaken.
Aërosolverontreiniging is de meest waarschijnlijke vorm van verontreiniging van PCR-producten en wordt ook het gemakkelijkst over het hoofd gezien.Het wordt gevormd door de wrijving tussen het vloeistofoppervlak en de lucht.Over het algemeen kan aërosolverontreiniging worden gevormd wanneer het deksel wordt geopend, wanneer het monster wordt opgezogen of zelfs wanneer de reageerbuis krachtig wordt geschud.Volgens berekeningen kan een aerosoldeeltje 48.000 kopieën bevatten, dus de vervuiling die daardoor ontstaat is een probleem dat speciale aandacht verdient.
Met name testlaboratoria gebruiken vaak hetzelfde paar primers om een bepaald gen te testen.In de laboratoriumruimte zal na verloop van tijd een grote hoeveelheid PCR-productverontreiniging optreden.Zodra een dergelijke verontreiniging optreedt, is het moeilijk om deze in korte tijd te verwijderen.
Voor de eerste drie soorten vervuiling kunnen we effectieve middelen gebruiken om te voorkomen, maar de vervuiling veroorzaakt door PCR-producten is moeilijk te voorkomen, vooral bij de bouw van niet-standaard PCR-laboratoria.Tijdens het PCR-proces, wanneer de pipetpunt de vloeistof aanzuigt en blaast en het deksel van de PCR-buis wordt geopend, wordt er een aerosol gevormd.De DNA-moleculen die door de aerosol worden meegevoerd (één aerosol kan tienduizenden DNA bevatten) zijn moeilijk te elimineren omdat ze in de lucht zweven.Zodra de volgende ronde van PCR-experimenten wordt geïntroduceerd, zullen er onvermijdelijk valse positieven optreden.
Zoals te zien is in de onderstaande afbeelding, versterkte de negatieve controle ook de overeenkomstige band van belang:
Het eerste deel van dit nummer over PCR-verontreiniging en -preventie wordt hier ingeleid.In het volgende nummer vindt u het tweede deel "Preventie van PCR-productbesmetting", dus houd het in de gaten!
Posttijd: 25 juli 2017
