Primer ontwerpbasis (99% problemen kunnen worden opgelost)
1. Primer-lengte: het leerboek vereist 15-30 bp, meestal ongeveer 20 bp.De werkelijke conditie is beter om 18-24 bp te zijn om de specificiteit te waarborgen, maar hoe langer hoe beter, een te lange primer zal ook de specificiteit verminderen en de opbrengst verminderen.
2. Primer-amplificatiebereik: 200-500 bp is geschikt en het fragment kan onder specifieke omstandigheden worden uitgebreid tot 10 kb.
3. Primerbasis: de inhoud van G+C moet 40-60% zijn, te weinig G+C-versterkingseffect is niet goed, te veel G+C is gemakkelijk om niet-specifieke banden te laten verschijnen.ATGC wordt het best willekeurig verdeeld, waarbij clusters van meer dan 5 purine- of pyrimidinenucleotiden worden vermeden.Multi-gc voor het 5'-uiteinde en tussenliggende reeksen om de stabiliteit te vergroten, vermijd rijke GC aan het 3'-uiteinde, geen GC voor de laatste 3 basen of geen GC voor 3 van de laatste 5 basen.
4. Vermijd secundaire structuur in primers en vermijd complementatie tussen twee primers, vooral complementatie aan het 3'-uiteinde, anders zal primerdimeer worden gevormd en zullen niet-specifieke geamplificeerde banden worden gegenereerd.
5. De basen aan het 3'-uiteinde van primers, in het bijzonder de laatste en voorlaatste basen, dienen strikt gekoppeld te zijn om PCR-falen als gevolg van ongepaarde terminale basen te voorkomen.
6. Primers hebben of kunnen worden toegevoegd met geschikte splitsingsplaatsen, en de geamplificeerde doelsequentie zou bij voorkeur geschikte splitsingsplaatsen moeten hebben, hetgeen zeer gunstig is voor splitsingsanalyse of moleculaire klonering.
7. Specificiteit van primers: primers mogen geen duidelijke homologie hebben met andere sequenties in de nucleïnezuursequentiedatabase.
8. Leer software gebruiken: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Dit online ontwerp werkt het beste).
De bovenstaande inhoud kan ten minste 99% van de problemen met het ontwerp van primers oplossen.
Beheer de details van het ontwerp van de primer
1. Primerlengte
De algemene primerlengte is 18~30 basen.Over het algemeen is de lengte van de primer de belangrijkste factor die de annealingstemperatuur van de primer bepaalt.De gloeitemperatuur van de primer wordt over het algemeen gekozen (Tm-waarde -5 ℃) en sommige gebruiken direct de Tm-waarde.De volgende formules kunnen worden gebruikt om de annealingstemperatuur van primers ruwweg te berekenen.
Wanneer de lengte van de inleiding minder is dan 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Wanneer de lengte van de primer groter is dan 20 bp: 62,3 ℃ + 0,41 ℃ (% GC) -500/lengte-5 ℃
Bovendien kan veel software ook worden gebruikt om de gloeitemperatuur te berekenen, het berekeningsprincipe zal anders zijn, dus soms kan de berekende waarde een kleine opening hebben.Om PCR-reacties te optimaliseren, worden de kortste primers gebruikt die zorgen voor annealingstemperaturen van niet minder dan 54 ℃ voor de beste efficiëntie en specificiteit.
Over het algemeen neemt de primerspecificiteit toe met een factor vier voor elke extra nucleotide, zodat de minimale primerlengte voor de meeste toepassingen 18 nucleotiden is.De bovengrens van de primerlengte is niet erg belangrijk, voornamelijk gerelateerd aan reactie-efficiëntie.Vanwege entropie geldt: hoe langer de primer, hoe lager de snelheid waarmee deze hecht om te binden aan het doel-DNA om een stabiele dubbelstrengige matrijs te vormen waaraan DNA-polymerase kan binden.
Wanneer software wordt gebruikt om primers te ontwerpen, kan de lengte van primers op zijn beurt worden bepaald door de TM-waarde, vooral voor primers van fluorescentie kwantitatieve PCR, TM = 60 ℃ of zo moet worden gecontroleerd.
2.GC-inhoud
Over het algemeen is het gehalte aan G+C in primersequenties 40%~60% en moeten het GC-gehalte en de Tm-waarde van een paar primers worden gecoördineerd.Als de primer een ernstige GC- of AT-neiging heeft, kan een geschikte hoeveelheid A-, T- of G- en C-staart worden toegevoegd aan het 5'-uiteinde van de primer.
3. Onthardingstemperatuur
De gloeitemperatuur moet 5 ℃ lager zijn dan de ontketeningstemperatuur.Als het aantal primerbasen klein is, kan de annealingstemperatuur op passende wijze worden verhoogd, wat de specificiteit van PCR kan verhogen.Als het aantal basen groot is, kan de annealingstemperatuur dienovereenkomstig worden verlaagd.Het annealingstemperatuurverschil tussen een paar primers van 4℃ ~ 6℃ heeft geen invloed op de PCR-opbrengst, maar idealiter is de annealingstemperatuur van een paar primers hetzelfde, die kan variëren tussen 55℃ ~ 75℃.
4. Vermijd het secundaire structuurgebied van het amplificatiesjabloon
Het is het beste om het secundaire structuurgebied van de sjabloon te vermijden bij het selecteren van het geamplificeerde fragment.De stabiele secundaire structuur van het doelfragment kan worden voorspeld en geschat door relevante computersoftware, wat handig is voor sjabloonselectie.Experimentele resultaten laten zien dat de expansie vaak niet succesvol is wanneer de vrije energie (△G) van het te expanderen gebied minder is dan 58,6 lkJ/mol.
5. Komt niet overeen met doel-DNA
Wanneer de geamplificeerde doelwit-DNA-sequentie groot is, kan een primer aan meerdere delen van het doelwit-DNA binden, waardoor meerdere banden in het resultaat verschijnen.Deze keer is het noodzakelijk om de BLAST-softwaretest, website te gebruiken:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Selecteer Lijn twee reeksen uit (bl2seq).
Het plakken van primersequenties in zone 1 en doel-DNA-sequenties in zone 2 is uitwisselbaar, en BLAST berekent complementaire, antisense en andere mogelijkheden, zodat gebruikers niet hoeven op te merken of beide ketens sense-ketens zijn.U kunt ook het GI-nummer invoeren als u het GI-nummer van de reeks in de database kent, zodat u niet een groot deel van de reeks hoeft te plakken.Klik ten slotte op Uitlijnen op 3 om te zien of de primer meerdere homologe sites in het doel-DNA heeft.
6. Primer-aansluiting
Het 3'-uiteinde van de primer is waar de extensie begint, dus het is belangrijk om te voorkomen dat mismatches daar beginnen.Het 3'-uiteinde mag niet meer zijn dan 3 opeenvolgende G of C, omdat hierdoor de primer per ongeluk wordt geactiveerd in het G+C-verrijkingssequentiegebied.Het 3'-uiteinde kan geen secundaire structuur vormen, behalve dat bij speciale PCR (AS-PCR)-reacties het 3'-uiteinde van de primer niet verkeerd kan worden gecombineerd.Als het coderende gebied bijvoorbeeld wordt geamplificeerd, mag het 3'-uiteinde van de primer niet eindigen op de derde positie van het codon, omdat de derde positie van het codon vatbaar is voor degenereren, wat de specificiteit en efficiëntie van amplificatie zal beïnvloeden.Raadpleeg bij het gebruik van annexatieprimers de codongebruikstabel, let op de biologische voorkeur, gebruik geen annexatieprimers aan het 3'-uiteinde en gebruik een hogere concentratie primers (1uM-3uM).
7. Secundaire structuur van primers
De primers zelf zouden geen complementaire sequenties moeten hebben, anders zullen de primers zelf vouwen tot haarspeldstructuren, en deze secundaire structuur zal de binding van primers en templates beïnvloeden als gevolg van sterische hindering.Als kunstmatige beoordeling wordt gebruikt, mogen de continue complementaire basen van primers zelf niet groter zijn dan 3 bp.Er mag geen complementariteit zijn tussen de twee primers, vooral de complementaire overlap van het 3'-uiteinde moet worden vermeden om de vorming van primerdimeren te voorkomen.Over het algemeen mag er niet meer dan 4 opeenvolgende basenhomologie of complementariteit zijn tussen een paar primers.
8. Voeg markeringen of loci toe
Het 5'-uiteinde heeft weinig effect op de amplificatiespecificiteit en kan daarom worden gewijzigd zonder de amplificatiespecificiteit te beïnvloeden.De modificatie van het uiteinde van primer 5 omvatte: het toevoegen van een enzymrestrictieplaats;Gelabelde biotine, fluorescentie, digoxine, Eu3+, enz. Introduceer eiwitbindende DNA-sequenties;Het introduceren van mutatieplaatsen, het invoegen en missen van mutatiesequenties en het introduceren van promotorsequenties, enz. De extra basen zullen min of meer de efficiëntie van amplificatie beïnvloeden en de kans op vorming van primerdimeren vergroten, maar er moeten enkele concessies worden gedaan voor de volgende stap.Aanvullende sequenties die niet voorkomen op de doelsequentie, zoals restrictieplaatsen en promotersequenties, kunnen aan het 5'-uiteinde van de primer worden toegevoegd zonder de specificiteit te beïnvloeden.Deze sequenties worden niet meegenomen in de berekening van primer Tm-waarden, maar moeten worden getest op complementariteit en interne secundaire structuur.
9. Subklonen
Meestal is PCR alleen voorlopig klonen en dan moeten we het doelfragment subkloneren in verschillende vectoren, dus moeten we extra bases ontwerpen voor de volgende operatie in de PCR-stap.
Enkele sequenties ontworpen voor subklonering worden hieronder samengevat.
Restrictie-endonuclease-restrictieplaats werd toegevoegd
Het toevoegen van enzymrestrictieplaatsen is de meest gebruikte methode voor het subkloneren van PCR-producten.Over het algemeen is de splitsingsplaats zes basen, naast het 5 'uiteinde van de splitsingsplaats moeten 2 ~ 3 beschermende basen worden toegevoegd.Het aantal beschermende basen dat nodig is voor verschillende enzymen is echter verschillend.SalⅠ vereist bijvoorbeeld geen beschermende basis, EcoRⅤ vereist 1 beschermende basis, NotⅠ vereist 2 beschermende bases en Hind Ⅲ vereist 3 beschermende bases.
LIC voegt de staart toe
De volledige naam van LIC is Ligation-Independent cloning, een kloonmethode die speciaal door Navogen is uitgevonden voor zijn deel van de pET-vector.De pET-drager die met de LIC-methode is bereid, heeft niet-complementaire kleverige uiteinden met een enkelstrengs basis van 12-15 basen, die de overeenkomstige kleverige uiteinden op het beoogde insertiefragment complementeren.Voor amplificatiedoeleinden moet de primer 5'-sequentie van het ingevoegde fragment de LIC-vector aanvullen.De 3'→5'-extractactiviteit van T4-DNA-polymerase kan na korte tijd een kleverig uiteinde van een enkele streng op het ingevoegde fragment vormen.Omdat het product alleen kan worden gevormd uit de wederzijdse versmelting van het voorbereide insertiefragment en de vector, is deze methode zeer snel en efficiënt en is het gericht klonen.
Geregisseerde TA-kloon voegt staart toe
TA-klonen was niet in staat om het fragment in een vector te richten, dus introduceerde Invitrogen later een vector die zich op klonen kon richten, die aan één uiteinde vier prominente basis-GTGGS bevatte.Daarom moeten bij het ontwerp van PCR-primers dienovereenkomstig complementaire sequenties worden toegevoegd, zodat fragmenten kunnen worden "georiënteerd".
Als je weinig tijd hebt, kun je directe synthese proberen, waarbij het gen wordt gecombineerd met de vector, wat we ET-gensynthese noemen bij musecularisten.
D. In-Fusion-kloneringsmethode
Geen ligase vereist, geen lange reactie vereist.Zolang een sequentie aan beide uiteinden van de gelineariseerde vector wordt geïntroduceerd bij het ontwerpen van primers, worden het PCR-product en de gelineariseerde vector toegevoegd aan de infusie-enzymoplossing die BSA bevat en gedurende een half uur bij kamertemperatuur geplaatst, kan de transformatie worden uitgevoerd.Deze methode is met name geschikt voor conversie van grote volumes.
10. Primer samenvoegen
Soms is slechts beperkte sequentie-informatie bekend over het ontwerp van primers.Als bijvoorbeeld alleen de aminozuursequentie bekend is, kan de samenvoegende primer worden ontworpen.Een fusieprimer is een mengsel van verschillende sequenties die alle verschillende basemogelijkheden vertegenwoordigen die coderen voor een enkel aminozuur.Om de specificiteit te verhogen, kunt u de codongebruikstabel raadplegen om annexatie te verminderen op basis van de basisgebruiksvoorkeuren van verschillende organismen.Hypoxanthine kan worden gecombineerd met alle basen om de annealingstemperatuur van de primer te verlagen.Gebruik de geannexeerde basen niet aan het 3'-uiteinde van de primer, omdat het uitgloeien van de laatste 3 basen aan het 3'-uiteinde voldoende is om PCR op de verkeerde plaats te starten.Er worden hogere primerconcentraties (1 μM tot 3 μM) gebruikt omdat primers in veel annexatiemengsels niet specifiek zijn voor de doeltemplate.
PCR-grondstoffencontrole
1. Primerhoeveelheid
De concentratie van elke primer is 0,1 ~ 1umol of 10 ~ 100pmol.Het is beter om het gewenste resultaat te bereiken met de minste hoeveelheid primer.Hoge primerconcentraties veroorzaken mismatch en niet-specifieke amplificatie, en vergroten de kans op het vormen van dimeren tussen primers.
2. Primerconcentratie
De concentratie van primers beïnvloedt de specificiteit.De optimale primerconcentratie ligt over het algemeen tussen 0,1 en 0,5 μM.Hogere primerconcentraties leiden tot amplificatie van niet-specifieke producten.
3. Onthardingstemperatuur van primer
Een andere belangrijke parameter voor primers is de smelttemperatuur (Tm).Dit is de temperatuur waarbij 50% van de primers en complementaire sequenties wordt weergegeven als dubbelstrengige DNA-moleculen.Tm is vereist om de PCR-gloeitemperatuur in te stellen.In het ideale geval is de annealingstemperatuur laag genoeg om effectieve hybridisatie van de primers met de doelsequentie te verzekeren, maar hoog genoeg om niet-specifieke binding te verminderen.Redelijke gloeitemperatuur van 55 ℃ tot 70 ℃.De gloeitemperatuur wordt over het algemeen 5 ℃ lager ingesteld dan de Tm van de primer.
Er zijn verschillende formules voor het instellen van Tm, die sterk variëren, afhankelijk van de gebruikte formule en de volgorde van de primers.Omdat de meeste formules een geschatte Tm-waarde geven, zijn alle gloeitemperaturen slechts een beginpunt.De specificiteit kan worden verbeterd door verschillende reacties te analyseren die de annealingstemperatuur geleidelijk verhogen.Begin onder de geschatte Tm-5℃ en verhoog geleidelijk de gloeitemperatuur in stappen van 2℃.Een hogere gloeitemperatuur zal de vorming van primerdimeren en niet-specifieke producten verminderen.Voor de beste resultaten moeten de twee primers ongeveer Tm-waarden hebben.Als het Tm-verschil van primerparen meer dan 5 ℃ is, zullen de primers een significante valse start vertonen door een lagere gloeitemperatuur in de cyclus te gebruiken.Als de twee primers Tm verschillend zijn, stelt u de gloeitemperatuur in op 5℃ lager dan de laagste Tm.Als alternatief kunnen, om de specificiteit te verhogen, eerst vijf cycli worden uitgevoerd bij annealingstemperaturen die zijn ontworpen voor hogere Tm, gevolgd door de resterende cycli bij annealingstemperaturen die zijn ontworpen voor lagere Tm.Hierdoor kan onder strikte voorwaarden een gedeeltelijke kopie van het bestemmingssjabloon worden verkregen.
4. Primer zuiverheid en stabiliteit
De standaardzuiverheid van op maat gemaakte primers is voldoende voor de meeste PCR-toepassingen.De verwijdering van benzoyl- en isobutylylgroepen door ontzouten is minimaal en stoort daarom de PCR niet.Sommige toepassingen vereisen zuivering om alle niet-volledige sequenties in het syntheseproces te verwijderen.Deze afgeknotte sequenties komen voor omdat de efficiëntie van DNA-synthesechemie niet 100% is.Dit is een circulair proces dat gebruik maakt van herhaalde chemische reacties waarbij elke base wordt toegevoegd om DNA van 3′ naar 5′ te maken.Je kunt in beide cycli falen.Langere primers, in het bijzonder die van meer dan 50 basen, hebben een groot deel afgeknotte sequenties en kunnen zuivering vereisen.
De opbrengst van primers wordt beïnvloed door de efficiëntie van synthetische chemie en zuiveringsmethode.Biofarmaceutische bedrijven, zoals Cytology en Shengong, gebruiken allemaal een minimale OD-eenheid om de totale output van oligonucleoside te garanderen.Aangepaste primers worden verzonden in droge poedervorm.Het is het beste om de primers opnieuw in TE op te lossen, zodat de uiteindelijke concentratie 100 μM is.TE is beter dan gedeïoniseerd water omdat de pH van water vaak zuur is en de hydrolyse van oligonucleosiden veroorzaakt.
De stabiliteit van primers hangt af van de opslagomstandigheden.Droog poeder en opgeloste primers moeten bij -20 ℃ worden bewaard.Primers opgelost in TE in concentraties van meer dan 10 μM kunnen stabiel worden bewaard bij -20 ℃ gedurende 6 maanden, maar kunnen alleen worden bewaard bij kamertemperatuur (15 ℃ tot 30 ℃) gedurende minder dan 1 week.Droge poederprimers kunnen minimaal 1 jaar bij -20 C en maximaal 2 maanden bij kamertemperatuur (15 C tot 30 C) worden bewaard.
5. Enzymen en hun concentraties
Op dit moment is de gebruikte Taq DNA-polymerase in feite het gen-manipulatie-enzym dat wordt gesynthetiseerd door coliforme bacteriën.De hoeveelheid enzym die nodig is om een typische PCR-reactie te katalyseren is ongeveer 2,5 U (verwijst naar het totale reactievolume van 100 µl).Als de concentratie te hoog is, kan dit leiden tot niet-specifieke amplificatie;als de concentratie te laag is, wordt de hoeveelheid synthetisch product verminderd.
6. Kwaliteit en concentratie van dNTP
De kwaliteit van dNTP hangt nauw samen met de concentratie en de efficiëntie van PCR-amplificatie.Het dNTP-poeder is korrelig en de variabiliteit verliest zijn biologische activiteit als het niet op de juiste manier wordt bewaard.dNTP-oplossing is zuur en moet in hoge concentratie worden gebruikt, met 1M NaOH of 1M Tris.HCL-bufferoplossing om de PH aan te passen aan 7,0 ~ 7,5, kleine hoeveelheid subverpakking, bevroren opslag bij -20 ℃.Meerdere keren bevriezen en ontdooien zal dNTP degraderen.Bij een PCR-reactie moet dNTP 50 ~ 200umol/L zijn.Er moet vooral op worden gelet dat de concentratie van de vier DNTPS gelijk moet zijn (equal mol preparation).Als de concentratie van een van hen verschilt van de andere (hoger of lager), zal er een mismatch worden veroorzaakt.Een te lage concentratie zal de opbrengst van PCR-producten verminderen.dNTP kan combineren met Mg2+ en de concentratie van vrij Mg2+ verminderen.
7. Sjabloon (doelgen) nucleïnezuur
De hoeveelheid en zuiveringsgraad van template-nucleïnezuur is een van de belangrijkste schakels voor het slagen of falen van PCR.De traditionele DNA-zuiveringsmethoden gebruiken meestal SDS en protease K om monsters te verteren en te verwijderen.De belangrijkste functies van SDS zijn: los lipiden en eiwitten op het celmembraan op, waardoor het celmembraan wordt vernietigd door membraaneiwitten op te lossen, en kerneiwitten in de cel te dissociëren, SDS kan ook worden gecombineerd met eiwitten en neerslaan;Protease K kan eiwitten hydrolyseren en verteren, vooral histonen gebonden aan DNA, en vervolgens fenol en chloroform als organisch oplosmiddel gebruiken om eiwitten en andere celcomponenten te extraheren, en ethanol of isopropylalcohol gebruiken om nucleïnezuur neer te slaan.Het geëxtraheerde nucleïnezuur kan worden gebruikt als een sjabloon voor PCR-reacties.Voor algemene klinische detectiespecimens kan een snelle en eenvoudige methode worden gebruikt om cellen op te lossen, pathogenen te lyseren, eiwitten van chromosomen te verteren en te verwijderen om doelgenen vrij te maken, en direct te gebruiken voor PCR-amplificatie.RNA-template-extractie gebruikt meestal de guanidine-isothiocyanaat- of protease K-methode om te voorkomen dat RNase RNA afbreekt.
8.Mg2+ concentratie
Mg2+ heeft een significant effect op de specificiteit en opbrengst van PCR-amplificatie.In de algemene PCR-reactie, wanneer de concentratie van verschillende dNTP 200umol/L is, is de juiste concentratie van Mg2+ 1,5 ~ 2,0 mmol/L.Mg2+-concentratie is te hoog, de reactiespecificiteit neemt af, niet-specifieke amplificatie treedt op, een te lage concentratie zal de activiteit van Taq DNA-polymerase verminderen, wat resulteert in de vermindering van reactieproducten.
Magnesiumionen beïnvloeden verschillende aspecten van PCR, zoals DNA-polymerase-activiteit, die de opbrengst beïnvloedt;Een ander voorbeeld is primer annealing, wat de specificiteit beïnvloedt.dNTP en template binden aan magnesiumion, waardoor de hoeveelheid vrij magnesiumion die nodig is voor enzymactiviteit wordt verminderd.De optimale magnesiumionenconcentratie varieert voor verschillende primerparen en sjablonen, maar een typische PCR-startconcentratie met 200 μM dNTP is 1,5 mM (opmerking: gebruik voor real-time kwantitatieve PCR 3 tot 5 mM magnesiumionenoplossing met een fluorescerende sonde).Hogere concentraties vrije magnesiumionen verhogen de opbrengst, maar verhogen ook de niet-specifieke amplificatie en verminderen de getrouwheid.Om de optimale concentratie te bepalen, werden titraties van magnesiumionen uitgevoerd in stappen van 0,5 mM van 1 mM tot 3 mM.Om de afhankelijkheid van optimalisatie van magnesiumionen te verminderen, kan Platinum Taq DNA-polymerase worden gebruikt.Platinum Taq DNA-polymerase kan de functie behouden over een breder bereik van magnesiumionconcentraties dan Taq DNA-polymerase en vereist daarom minder optimalisatie.
9. Pcr-bevorderende additieven
Optimalisatie van de annealingstemperatuur, het primerontwerp en de magnesiumionenconcentratie is voldoende voor zeer specifieke amplificatie van de meeste templates;sommige sjablonen, waaronder sjablonen met een hoog GC-gehalte, vereisen echter aanvullende maatregelen.Additieven die de smelttemperatuur van DNA beïnvloeden, bieden een andere manier om de productspecificiteit en opbrengst te verbeteren.Volledige denaturatie van de sjabloon is vereist voor de beste resultaten.
Bovendien voorkomt de secundaire structuur primerbinding en enzymverlenging.
PCR-additieven, waaronder formamide, DMSO, glycerine, betaïne en PCRx Enhancer Solution, verbeteren de amplificatie.Hun mogelijke mechanisme is om de smelttemperatuur te verlagen, waardoor het uitgloeien van primers wordt bevorderd en de uitbreiding van DNA-polymerase door het gebied van de secundaire structuur wordt ondersteund.PCRx-oplossing heeft nog andere voordelen.Minimale optimalisatie van magnesiumionen is vereist bij gebruik met Platinum Taq DNA-polymerase en Platinum Pfx DNA-polymerase.Zo wordt de platinatechniek gecombineerd met het additief om de specificiteit te verhogen en tegelijkertijd de afhankelijkheid van de derde benadering, de optimalisatie van magnesiumionen, te verminderen.Voor de beste resultaten moet de concentratie van additieven worden geoptimaliseerd, met name DMSO, formamide en glycerol, die Taq DNA-polymerase remmen.
10. Hete start
Hot start PCR is naast een goed primerontwerp een van de belangrijkste methoden om de PCR-specificiteit te verbeteren.Hoewel de optimale rektemperatuur van Taq DNA-polymerase 72℃ is, blijft de polymerase actief bij kamertemperatuur.Er worden dus niet-specifieke producten geproduceerd wanneer de bewaartemperatuur lager is dan de annealingstemperatuur tijdens de voorbereiding van de PCR-reactie en aan het begin van de thermische cyclus.Eenmaal gevormd, worden deze niet-specifieke producten effectief versterkt.Hot-start PCR is met name effectief wanneer de locaties die worden gebruikt voor het ontwerpen van primers worden beperkt door de locatie van genetische elementen, zoals plaatsgerichte mutaties, expressieklonen of constructie en manipulatie van genetische elementen die worden gebruikt voor DNA-engineering.
Een veelgebruikte methode om de activiteit van Taq DNA-polymerase te beperken, is door PCR-reactieoplossing op ijs te bereiden en in een voorverwarmd PCR-apparaat te plaatsen.Deze methode is eenvoudig en goedkoop, maar voltooit de activiteit van het enzym niet en elimineert daarom de amplificatie van niet-specifieke producten niet volledig.
Thermische priming vertraagt de DNA-synthese door een essentiële component te remmen totdat het PCR-apparaat de denaturatietemperatuur bereikt.De meeste handmatige thermische initiatiemethoden, inclusief vertraagde toevoeging van Taq DNA-polymerase, zijn omslachtig, vooral voor toepassingen met een hoge doorvoer.Andere thermische priming-methoden gebruiken een wasschild om een essentieel onderdeel, inclusief magnesiumionen of enzymen, in te sluiten of om reactieve componenten, zoals sjablonen en buffers, fysiek te isoleren.Tijdens de thermische cyclus komen de verschillende componenten vrij en worden ze gemengd terwijl de was smelt.Net als de handmatige hotstart-methode is de wasschildmethode omslachtig en vatbaar voor vervuiling en niet geschikt voor toepassingen met een hoge doorvoer.
Platina-DNA-polymerase is handig en efficiënt voor automatische hotstart-PCR.Platinum Taq DNA-polymerase bestaat uit recombinant Taq DNA-polymerase gecombineerd met monoklonaal antilichaam tegen Taq DNA-polymerase.De antilichamen worden geformuleerd door middel van PCR om enzymactiviteit te remmen tijdens langdurige temperatuurbehoud.Taq DNA-polymerase kwam vrij in de reactie tijdens de 94°C-isolatie van de denaturatiestap, waardoor de volledige polymerase-activiteit werd hersteld.In tegenstelling tot chemisch gemodificeerd Taq DNA-polymerase voor thermische initiatie, vereist platina-enzym geen langdurige isolatie bij 94 ℃ (10 tot 15 minuten) om het polymerase te activeren.Met PlatinumTaq DNA-polymerase was 90% van de Taq DNA-polymerase-activiteit na 2 minuten bij 94°C hersteld.
11. Nest-PCR
Opeenvolgende amplificatierondes met behulp van geneste primers kunnen de specificiteit en gevoeligheid verbeteren.De eerste ronde is een standaard versterking van 15 tot 20 cycli.Een kleine fractie van het initiële amplificatieproduct werd 100 tot 1000 keer verdund en toegevoegd aan de tweede amplificatieronde gedurende 15 tot 20 cycli.Als alternatief kan het initiële geamplificeerde product op maat worden gemaakt door middel van gelzuivering.In de tweede amplificatieronde wordt een geneste primer gebruikt, die kan binden aan de doelsequentie in de eerste primer.Het gebruik van geneste PCR verkleint de mogelijkheid van amplificatie van meerdere doelwitplaatsen omdat er weinig doelwitsequenties zijn die complementair zijn aan beide reeksen primers.Hetzelfde totale aantal cycli (30 tot 40) met dezelfde primers amplificeerden de niet-specifieke plaatsen.Geneste PCR verhoogt de gevoeligheid van beperkte doelsequenties (bijv. zeldzame mrna's) en verbetert de specificiteit van moeilijke PCRS (bijv. 5' RACE).
12. Aflopende PCR
Aflopende PCR verbetert de specificiteit door tijdens de eerste paar PCR-cycli strakke annealing-omstandigheden te gebruiken.De cyclus begint bij een uitgloeitemperatuur die ongeveer 5℃ hoger is dan de geschatte Tm, daarna wordt elke cyclus met 1℃ tot 2℃ verlaagd totdat de uitgloeitemperatuur lager is dan Tm 5℃.Alleen de bestemmingssjabloon met de hoogste homologie wordt versterkt.Deze producten blijven zich uitbreiden in volgende cycli, waardoor de versterkte niet-specifieke producten worden verdrongen.Descending PCR is nuttig voor methoden waarbij de mate van homologie tussen primer en targettemplate niet bekend is, zoals AFLP DNA-fingerprinting.
Gerelateerde PCR-kits
De 2× PCR-heldTMMix-systeem heeft een hogere tolerantie voor PCR-remmers dan het gewone PCR Mix-systeem en kan gemakkelijk omgaan met PCR-amplificatie van verschillende complexe templates.Het unieke reactiesysteem en de zeer efficiënte Taq Hero zorgen ervoor dat de PCR-reactie een hogere amplificatie-efficiëntie, specificiteit en gevoeligheid heeft.
Hogere versterkingsefficiëntie
Het heeft 5'→3'-DNA-polymerase-activiteit en 5'→3'-exonuclease-activiteit, zonder 3'→5'-exonuclease-activiteit.
Realtime PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Specifiek - geoptimaliseerde buffer en hot-start Taq-enzym kunnen niet-specifieke amplificatie en primerdimeervorming voorkomen
Hoge gevoeligheid: kan kleine exemplaren van een sjabloon detecteren
De kit maakt gebruik van een uniek Foregene reverse transcriptiereagens en Foregene HotStar Taq DNA-polymerase gecombineerd met een uniek reactiesysteem om de amplificatie-efficiëntie en specificiteit van de reactie effectief te verbeteren.
Posttijd: 09-05-2023
