Ik geloof dat iedereen bij het uitvoeren van PCR-reacties altijd wel een of ander probleem zal tegenkomen, maar de meeste kunnen in twee hoofdproblemen worden ingedeeld:

Te weinig amplificatie van de gentemplate (amplificatie);
Te veel non-target genamplificatie.
Het gebruik van additieven is een van de gebruikelijke strategieën om deze problemen op te lossen.Gewoonlijk heeft de rol van additieven twee aspecten:
secundaire structuurvan genen (secundaire structuur);
Verminder niet-specifieke priming.
Vandaag zal de redacteur u kort kennis laten maken met de gebruikelijke additieven in PCR-reacties en hun functies.
Additieven die de secundaire structuur verminderen
sulfoxide(DMSO)
gen monstersmet een hoog GC-gehalte.DMSO vermindert echter ook de Taq-polymerase-activiteit aanzienlijk.Daarom moet iedereen de sjabloontoegankelijkheid en de activiteit van de polymerase in evenwicht houden.De redacteur suggereert dat u verschillende concentraties van DSMO kunt proberen, zoals van 2% tot 10%, om de concentratie te vinden die bij uw experiment past.
Niet-ionische wasmiddelen
Niet-ionische wasmiddelen, zoals 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 of NP-40, verminderen meestal de secundaire DNA-structuur.Hoewel dit de amplificatie van het template-gen kan verhogen, zal het ook het probleem van niet-specifieke amplificatie veroorzaken.Deze additieven werken dus goed voor PCR-reacties met lage opbrengst zonder afval, maar niet zo goed voor relatief onzuivere PRC-reacties.Een ander voordeel van niet-ionische wasmiddelen is de vermindering van SDS-verontreiniging.Gewoonlijk zal tijdens het DNA-extractieproces SDS naar de PCR-stap worden gebracht, wat de activiteit van het polymerase sterk remt.Daarom kan het toevoegen van 0,5% Tween-20 of Tween-40 aan de reactie de negatieve effecten van SDS neutraliseren.
betaïne_
Betaïne kan de DNA-amplificatie verbeteren door de vorming van secundaire structuren te verminderen en is over het algemeen een "mysterieuze" toevoeging aan commerciële PCR-kits.Als u betaïne wilt gebruiken, moet u betaïne of betaïne-monohydraat (Betaine of Betaine-monohydraat) gebruiken, maar geen betaïne-hydrochloride (Betaine HCl), aanpassen tot een eindconcentratie van 1-1,7 M.Betaïne kan ook helpen de specificiteit te verbeteren, omdat het de afhankelijkheid van de basenpaarsamenstelling van DNA-smelting/DNA-denaturatie elimineert.
Additieven om niet-specifieke priming te verminderen
Formamide
Formamide is een veelgebruikt organisch PCR-additief.Het kan worden gecombineerd met grote groeven en kleine groeven in DNA, waardoor de stabiliteit van de master-DNA-dubbele helix wordt verminderd en de smelttemperatuur van DNA wordt verlaagd.De concentratie formamide die in PCR-experimenten wordt gebruikt, is gewoonlijk 1%-5%.
tetramethylammoniumchloride( TMAC)
Tetramethylammoniumchloride kan de specificiteit van hybridisatie (hybridisatiespecificiteit) verhogen en de smelttemperatuur van DNA verhogen.TMAC kan dus niet-specifieke priming verwijderen en verkeerde binding van DNA en RNA verminderen.Als je gebruiktgedegenereerde primersvergeet niet om in de PCR-reactie TMAC toe te voegen, dat gewoonlijk wordt gebruikt in een concentratie van 15-100 mM.
Andere veel voorkomende toevoegingen
Naast de twee hierboven genoemde categorieën additieven, zijn er veel voorkomende additieven in PCR-reacties, hoewel ze verschillende functies hebben, zijn ze ook erg belangrijk.
Magnesium ion
Magnesiumion is een onmisbare cofactor (cofactor) van polymerase, dat wil zeggen zonder magnesiumion is polymerase inactief.Te veel magnesiumionen kunnen echter ook de efficiëntie van de polymerase beïnvloeden.De concentratie van magnesiumionen in elke PCR-reactie zal variëren.Chelaatvormers (zoals EDTA of citraat), de concentratie van dNTP's en eiwitten hebben allemaal invloed op de concentratie van magnesiumionen.Dus als je problemen hebt met je PCR-experiment, kun je proberen verschillende magnesiumionconcentraties te veranderen, bijvoorbeeld van 1,0 naar 4,0 mM, met een interval van 0,5–1 mM ertussen.
Het is vermeldenswaard dat meerdere vries-ontdooicycli kunnen leiden tot concentratiestratificatie van de magnesiumchloride-oplossing.Daarom moet u het voor elk gebruik volledig oplossen en goed mengen voordat u het gebruikt.
Runderserumalbumine(Runderalbumine, BSA)
Bij moleculaire chemie-experimenten is runderserumalbumine een veel voorkomend additief, vooral bij restrictie-enzymdigestie en PCR-experimenten.Bij PCR-reacties is BSA nuttig bij het verminderen van verontreinigingen zoals fenolische verbindingen.En er wordt ook gezegd dat het de hechting van reactanten aan de wand van de reageerbuis kan verminderen.Bij de PCR-reactie kan de toegevoegde concentratie BSA gewoonlijk 0,8 mg/ml bereiken.
 
Gerelateerde producten:
PCR-held(met kleurstof)
PCR-held