In het vroege stadium van de uitbraak is, vanwege de snelle ontwikkeling, een snelle diagnose van verdachte patiënten de sleutel tot het voorkomen van COVID-19.Sommige goedgekeurde reagentia voor nucleïnezuurdetectie hebben een korte ontwikkelingstijd en er zijn problemen zoals overhaaste prestatiebevestiging, onvoldoende optimalisering van het reagens en grote verschillen tussen batches;De problemen van verschillende klinische laboratoria in verschillende aspecten van het nucleïnezuurdetectieproces kunnen ook van invloed zijn op de nauwkeurigheid van de nucleïnezuurdetectieresultaten.Dit artikel zal zich concentreren op de belangrijkste links en punten in de huidige SARS-CoV-2-nucleïnezuurdetectie, en de problemen analyseren van vals-negatieve en positieve heronderzoeken van laboratoriumnucleïnezuurdetectie en klinische inconsistentie.

Principes van SARS-CoV-2-nucleïnezuurdetectie

SARS-CoV-2 is een RNA-virus met een genoomsequentie van ongeveer 29 kb, met 10 genen, die effectief 10 eiwitten kunnen coderen.Virussen zijn samengesteld uit RNA en eiwit, en de buitenste laag is een buitenste laag die bestaat uit lipiden en glycoproteïnen.Binnenin wikkelt het eiwitcapside het RNA erin, waardoor het gemakkelijk afbreekbare RNA (P1) wordt beschermd.

P1 Structuur van SARS-COV-2

Virussen dringen cellen binnen via specifieke receptoren op het celoppervlak om infectie te veroorzaken en gebruiken gastheercellen om zich te vermenigvuldigen.

Het principe van virale nucleïnezuurdetectie is om het virale RNA bloot te leggen via een cellysaat en vervolgens real-time fluorescerende reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) te gebruiken voor detectie.

De sleutel tot het detectieprincipe is om primers en probes te gebruiken om "gerichte matching" van nucleïnezuursequenties te bereiken, dat wil zeggen om de nucleïnezuursequentie van SARS-CoV-2 te vinden die verschilt van andere virussen in ongeveer 30.000 basen (de gelijkenis van nucleïnezuur met andere virussen) "Low" gebied), ontwerp primers en probes.

De primers en probes zijn sterk afgestemd op het specifieke gebied van SARS-CoV-2-nucleïnezuur, dat wil zeggen dat de specificiteit erg sterk is.Zodra het real-time fluorescerende RT-PCR-amplificatieresultaat van het te testen monster positief is, bewijst dit dat SARS-CoV-2 in het monster aanwezig is.Zie P2.

P2 Stappen van SARS-CoV-2 nucleïnezuurbepaling (real-time fluorescerende RT-PCR)

Voorwaarden en vereisten van het laboratorium voor SARS-CoV-2-nucleïnezuurdetectie

Laboratoria voor het testen van nucleïnezuren zijn het meest ideaal voor omgevingen met negatieve druk, en ze moeten aandacht besteden aan drukbewaking, de lucht laten stromen en aerosolen elimineren.Het personeel dat nucleïnezuur test, moet overeenkomstige kwalificaties hebben, relevante polymerasekettingreactietraining volgen en slagen voor de beoordeling.Het laboratorium moet strikt worden beheerd, zijn gezoneerd en het is ten strengste verboden voor irrelevant personeel om binnen te komen.De schone ruimte moet ter plaatse worden geventileerd en gedesinfecteerd.Relevante items worden in zones geplaatst, schoon en vuil worden gescheiden, op tijd vervangen en ter plekke ontsmet.Routinematige desinfectie: chloorhoudend desinfectiemiddel is de belangrijkste oplossing voor grotere gebieden en 75% alcohol kan worden gebruikt voor kleine gebieden.Een goede manier om met aerosolen om te gaan, is door ramen te openen voor ventilatie, en luchtdesinfectie kan ook worden uitgevoerd door middel van ultraviolette stralen, filtratie en luchtdesinfectie.

Belangrijkste links en parameters van SARS-CoV-2 nucleïnezuurbepaling (real-time fluorescerende RT-PCR)

Hoewel laboratoria over het algemeen veel aandacht besteden aan de "detectie" van nucleïnezuur, is de "extractie" van nucleïnezuur in feite ook een van de belangrijkste stappen voor succesvolle detectie, die nauw verband houdt met het verzamelen en opslaan van virusmonsters.

Momenteel gebruiken de meest gebruikte respiratoire monsters, zoals nasofaryngeale uitstrijkjes, de tweede methode, een inactiveringsoplossing (conservering) die is bereid op basis van nucleïnezuurextractie en lysisoplossing.Enerzijds kan deze virusconserveringsoplossing het eiwit van het virus denatureren, zijn activiteit verliezen en niet langer besmettelijk zijn, en de veiligheid van de transport- en detectiefase verbeteren;aan de andere kant kan het het virus direct kraken om het nucleïnezuur vrij te maken, het nucleïnezuur-ontbindende enzym te elimineren en het virus te voorkomen.Het RNA is afgebroken.

Een virusbemonsteringsoplossing bereid op basis van nucleïnezuurextractie-lysisoplossing.De belangrijkste componenten zijn uitgebalanceerde zouten, ethyleendiaminetetraazijnzuurchelaatvormer, guanidinezout (guanidine-isothiocyanaat, guanidinehydrochloride, enz.), Anionische oppervlakteactieve stof (dodecaan) Natriumsulfaat), kationische oppervlakteactieve stof (tetradecyltrimethylammoniumoxalaat), fenol, 8-hydroxyquinoline, dithiothreitol, proteïnase K en andere verschillende of meer componenten.Momenteel zijn er veel soorten nucleïnezuurextractiekits en worden verschillende nucleïnezuurextractie- en zuiveringsreagentia gebruikt.Zelfs als hetzelfde extractie- en zuiveringsreagens voor nucleïnezuur wordt gebruikt, zijn de extractieprocedures van elke kit verschillend.

Op dit moment worden de producten van de nucleïnezuurdetectiekit die zijn goedgekeurd door de National Medical Products Administration, geselecteerd op basis van de ORF1ab-, E- en N-genen in het SARS-CoV-2-genoom.De detectieprincipes van verschillende producten zijn in principe hetzelfde, maar hun primers en probe-ontwerpen zijn verschillend.Er zijn segmenten met één doel (ORF1ab), segmenten met twee doelen (ORF1ab, N of E) en segmenten met drie doelen (ORF1ab, N en E).Het verschil tussen detectie en interpretatie, nucleïnezuurextractie en real-time fluorescerend RT-PCR-reactiesysteem moet verwijzen naar de relevante kitinstructies, en het wordt aanbevolen dat gebruikers strikt de interpretatiemethode volgen die is gespecificeerd in de kitinstructies voor interpretatie.De gemeenschappelijke regio's, primers en probe-sequenties geamplificeerd door real-time fluorescerende RT-PCR worden getoond in P3.

P3 De locatie van het SARS-CoV-2-amplicondoel op het genoom en de sequentie van primers en probes

Interpretatie van de resultaten van SARS-CoV-2-nucleïnezuurbepaling (Rpaling-Ttijd fluorescerende RT-PCR)

“Pneumonia Prevention and Control Plan for SARS-CoV-2 Infection (Second Edition)” verduidelijkte voor het eerst de criteria voor het beoordelen van de resultaten van enkelvoudige genamplificatie:

1. Geen Ct of Ct≥40 is negatief;

2. Ct<37 is positief;

3. De Ct-waarde van 37-40 is het grijsschaalgebied.Het wordt aanbevolen om het experiment te herhalen.Als het resultaat van het opnieuw uitvoeren van Ct<40 en de amplificatiecurve duidelijke pieken heeft, wordt het monster als positief beoordeeld, anders is het negatief.”

De derde editie van de gids en de vierde editie van de gids zetten bovenstaande criteria voort.Vanwege de verschillende doelen die in commerciële kits worden gebruikt, gaf de bovengenoemde 3e editie van de gids echter niet de criteria voor het bepalen van de combinatie van doelen, met de nadruk dat de instructies van de fabrikant doorslaggevend zijn.Vanaf de vijfde editie van de richtlijnen zijn twee doelen verduidelijkt, met name de beoordelingscriteria voor één moeilijk te beoordelen doel.Dat wil zeggen, als het laboratorium wil bevestigen dat een geval positief is voor SARS-CoV-2-nucleïnezuurdetectie, moet aan 1 van de 2 voorwaarden worden voldaan:

(1) Twee doelen van SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) in hetzelfde monster worden positief getest door real-time fluorescerende RT-PCR.Als een enkel doelwit positief is, zijn opnieuw bemonsteren en opnieuw testen vereist.Als de testresultaten zijn Als het enkele doelwit nog steeds positief is, wordt het als positief beoordeeld.

(2) Twee monsters van real-time fluorescerende RT-PCR toonden tegelijkertijd een enkel doel positief of twee monsters van hetzelfde type vertoonden een enkel doel positief testresultaat, dat als positief kan worden beoordeeld.De richtlijnen benadrukken echter ook dat de negatieve resultaten van nucleïnezuurtesten SARS-CoV-2-infectie niet kunnen uitsluiten.Factoren die fout-negatieven kunnen veroorzaken, moeten worden uitgesloten, waaronder slechte monsterkwaliteit (ademhalingsmonsters van orofarynx en andere delen), monsterverzameling te vroeg of te laat, monsters werden niet correct opgeslagen, vervoerd en verwerkt, en de technologie zelf had problemen (virusvariatie, PCR-remming), enz.

Oorzaken van fout-negatieven bij de SARS-CoV-2-detectie

Het concept van "vals-negatief" bij nucleïnezuurtesten waar het momenteel om gaat, verwijst vaak naar "vals-negatieven" waarbij de resultaten van de nucleïnezuurtest niet stroken met klinische manifestaties, dat wil zeggen dat klinische symptomen en beeldvormingsresultaten sterk worden verdacht van COVID-19, maar nucleïnezuurtesten zijn altijd vaak "negatief".Het Clinical Laboratory Centre van de National Health Commission legde de “vals-negatieve” SARS-CoV-2-test uit.

(1) Er is een bepaalde hoeveelheid virus in de cellen van de geïnfecteerde persoon.Bestaande gegevens tonen aan dat nadat het lichaam door het virus is geïnfecteerd, het virus de keel binnendringt via de neus en mond, vervolgens naar de luchtpijp en de bronchiën en vervolgens de longblaasjes bereikt.De geïnfecteerde persoon zal de incubatietijd, milde symptomen en vervolgens het proces van ernstige symptomen en verschillende stadia van de ziekte ervaren.En de hoeveelheid virus die in verschillende delen van het lichaam aanwezig is, is verschillend.

In termen van de virale belasting van celtypen, alveolaire epitheelcellen (onderste luchtwegen)> luchtwegepitheelcellen (bovenste luchtwegen)> fibroblasten, endotheelcellen en macrofagen, enz.;van het monstertype, alveolaire lavage-vloeistof (de meest uitstekende)>diep hoestend sputum>nasofaryngeaal uitstrijkje>orofaryngeaal uitstrijkje>bloed.Daarnaast kan het virus ook in de ontlasting worden aangetoond.Gezien het bedieningsgemak en de acceptatie door patiënten, is de meest gebruikte volgorde van klinische monsters orofaryngeaal uitstrijkje>nasofaryngeaal uitstrijkje>bronchiale lavagevloeistof (complexe operatie) en diep sputum (meestal droge hoest, moeilijk te verkrijgen).

Daarom is de hoeveelheid virus in de cellen van de orofarynx of nasopharynx van sommige patiënten klein of extreem laag.Als alleen monsters van de orofarynx of nasopharynx worden genomen om te testen, wordt het virale nucleïnezuur niet gedetecteerd.

(2) Er werden geen virusbevattende cellen verzameld tijdens het verzamelen van monsters, of viraal nucleïnezuur werd niet effectief bewaard.

[① Onjuiste verzamelplaats, bijvoorbeeld bij het afnemen van orofaryngeale uitstrijkjes, de afnamediepte is niet voldoende, de verzamelde nasofaryngeale uitstrijkjes worden niet diep in de neusholte afgenomen, enz. De meeste verzamelde cellen kunnen virusvrije cellen zijn;

②Sampling-swabs worden verkeerd gebruikt.Zo worden synthetische vezels zoals PE-vezel, polyestervezel en polypropyleenvezel aanbevolen voor het materiaal van de wattenstaafkop.Natuurlijke vezels zoals katoen worden in de praktijk gebruikt (sterke adsorptie van eiwitten en niet gemakkelijk uit te wassen) en nylonvezels (slechte wateropname, wat leidt tot onvoldoende bemonsteringsvolume);

③Onjuist gebruik van virusopslagbuisjes, zoals verkeerd gebruik van polypropyleen of polyethyleen plastic opslagbuisjes die gemakkelijk nucleïnezuren (DNA/RNA) absorberen, wat resulteert in een afname van de concentratie van nucleïnezuur in de bewaaroplossing.In de praktijk wordt aanbevolen om polyethyleen-propyleen polymeer plastic en sommige speciaal behandelde polypropyleen plastic containers te gebruiken om virale nucleïnezuren op te slaan.]

[① Onjuiste verzamelplaats, bijvoorbeeld bij het afnemen van orofaryngeale uitstrijkjes, de afnamediepte is niet voldoende, de verzamelde nasofaryngeale uitstrijkjes worden niet diep in de neusholte afgenomen, enz. De meeste verzamelde cellen kunnen virusvrije cellen zijn;

②Sampling-swabs worden verkeerd gebruikt.Zo worden synthetische vezels zoals PE-vezel, polyestervezel en polypropyleenvezel aanbevolen voor het materiaal van de wattenstaafkop.Natuurlijke vezels zoals katoen worden in de praktijk gebruikt (sterke adsorptie van eiwitten en niet gemakkelijk uit te wassen) en nylonvezels (slechte wateropname, wat leidt tot onvoldoende bemonsteringsvolume);

③Onjuist gebruik van virusopslagbuisjes, zoals verkeerd gebruik van polypropyleen of polyethyleen plastic opslagbuisjes die gemakkelijk nucleïnezuren (DNA/RNA) absorberen, wat resulteert in een afname van de concentratie van nucleïnezuur in de bewaaroplossing.In de praktijk wordt aanbevolen om polyethyleen-propyleen polymeer plastic en sommige speciaal behandelde polypropyleen plastic containers te gebruiken om virale nucleïnezuren op te slaan.]

(4) De werking van het klinisch laboratorium is niet gestandaardiseerd.Monstertransport- en opslagomstandigheden, gestandaardiseerde werking van klinische laboratoria, interpretatie van resultaten en kwaliteitscontrole zijn de belangrijkste factoren om de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van testresultaten te waarborgen.Volgens de resultaten van de externe kwaliteitsevaluatie uitgevoerd door het Clinical Laboratory Centre van de National Health Commission op 16-24 maart 2020, waren van de 844 laboratoria die geldige resultaten ontvingen, 701 (83,1%) gekwalificeerd en 143 (16,9%) niet.Gekwalificeerd, de algehele testomstandigheden in het laboratorium zijn goed, maar verschillende laboratoria hebben nog steeds verschillen in het vermogen van het personeel, het interpretatievermogen van positieve monsters met één doel en kwaliteitscontrole.

Hoe het vals-negatief van SARS-CoV-2-nucleïnezuurdetectie te verminderen?

Het verminderen van fout-negatieven bij de detectie van nucleïnezuren moet worden geoptimaliseerd vanuit de vier aspecten van het produceren van fout-negatieven.

(1) Er is een bepaalde hoeveelheid virus in de cellen van de geïnfecteerde persoon.De concentratie van het virus in verschillende delen van het lichaam van vermoedelijk besmette personen zal op verschillende tijdstippen anders zijn.Als er geen farynx is, kan het in bronchiale lavagevloeistof of ontlasting zijn.Als meerdere soorten monsters tegelijkertijd of in verschillende stadia van ziekteprogressie kunnen worden verzameld om te testen, helpt dit om fout-negatieven te voorkomen.

(2) Cellen die virus bevatten, moeten worden verzameld tijdens de monstername.Dit probleem kan voor een groot deel worden opgelost door de training van monsterverzamelaars te versterken.

(3) Betrouwbare IVD-reagentia.Door op landelijk niveau onderzoek te doen naar de detectieprestatie-evaluatie van reagentia en de bestaande problemen te bespreken, kan de detectie-efficiëntie van reagentia verder worden verbeterd en de gevoeligheid van de analyse worden verbeterd.

(4) Gestandaardiseerde werking van klinische laboratoria.Door de training van het laboratoriumpersoneel te versterken, het kwaliteitsmanagementsysteem van het laboratorium continu te verbeteren, te zorgen voor redelijke verdelingen en het vermogen van het personeel om te detecteren te verbeteren, is het mogelijk om fout-negatieven als gevolg van onjuiste laboratoriumactiviteiten te verminderen.

Redenen voor de hertestpositieve SARS-CoV-2-nucleïnezuurtest bij herstelde en ontslagen patiënten

Het “COVID-19-diagnose- en behandelplan (Trial Seventh Edition)” bepaalt duidelijk dat een van de criteria voor COVID-19-patiënten om te genezen en uit het ziekenhuis te worden ontslagen, is dat twee opeenvolgende monsters van de luchtwegen een negatieve nucleïnezuurtest hebben (minstens 24 uur uit elkaar), maar er zijn er maar heel weinig. De SARS-CoV-2-nucleïnezuurtest was om verschillende redenen weer positief bij ontslagen patiënten.

(1)SARS-CoV-2 is een nieuw virus.Het is noodzakelijk om het pathogene mechanisme, het volledige beeld van de veroorzaakte ziekte en de kenmerken van het ziekteverloop verder te begrijpen.Daarom is het aan de ene kant noodzakelijk om het beheer van ontslagen patiënten te versterken en 14 dagen medische observatie uit te voeren.Voer follow-up, gezondheidsmonitoring en gezondheidsbegeleiding uit om het begrip van het hele proces van het ontstaan, de ontwikkeling en de uitkomst van de ziekte te verdiepen.

(2) De patiënt kan opnieuw met het virus worden geïnfecteerd.Academicus Zhong Nanshan zei: Omdat genezen patiënten antilichamen hebben, kan SARS-CoV-2 worden geëlimineerd door antilichamen wanneer ze opnieuw binnendringen.Er zijn veel redenen die de oorzaak kunnen zijn van de herstelde patiënt, of het kan verband houden met de mutatie van het virus, of zelfs de oorzaak van laboratoriumonderzoek.Als het het virus zelf is, kan de SARS-CoV-2-mutatie ervoor zorgen dat het antilichaam dat door de herstelde patiënt wordt geproduceerd, niet effectief is tegen het gemuteerde virus.Als de patiënt opnieuw wordt geïnfecteerd met het gemuteerde virus, kan de nucleïnezuurtest weer positief zijn.

(3) Wat de testmethoden in het laboratorium betreft, heeft elke testmethode zijn beperkingen.SARS-CoV-2-nucleïnezuurdetectie is te wijten aan de keuze van de gensequentie, de samenstelling van reagentia, de gevoeligheid van de methode en andere redenen, waardoor de bestaande kits hun eigen lagere detectielimieten hebben.Nadat de patiënt is behandeld, neemt het virus in het lichaam af.Wanneer de virale lading in het te testen monster onder de onderste detectiegrens ligt, verschijnt er een "negatief" resultaat.Dit resultaat betekent echter niet dat het virus in het lichaam volledig is verdwenen.Het virus kan ontstaan ​​nadat de behandeling is gestopt.Resurgence”, doorgaan met kopiëren.Daarom wordt aanbevolen om binnen 2 tot 4 weken na ontslag één keer per week te controleren.

(4) Nucleïnezuur is het genetisch materiaal van het virus.Het virus wordt gedood nadat de patiënt een antivirale behandeling heeft ondergaan, maar de resterende virale RNA-fragmenten blijven nog in het menselijk lichaam achter en worden niet volledig uit het lichaam afgevoerd.Soms, onder bepaalde omstandigheden, kan het meer behouden blijven.Een lange tijd, en op dit moment zal de nucleïnezuurtest "voorbijgaand" positief zijn.Met de verlenging van de hersteltijd van de patiënt, nadat de resterende RNA-fragmenten in het lichaam geleidelijk zijn uitgeput, kan het resultaat van de nucleïnezuurtest negatief worden.

(5) Het resultaat van de nucleïnezuurtest van SARS-CoV-2 bewijst alleen de aanwezigheid of afwezigheid van viraal RNA, en kan niet de activiteit van het virus bewijzen en of het virus overdraagbaar is.Het is noodzakelijk om te bewijzen of een patiënt die opnieuw een positieve nucleïnezuurtest heeft, opnieuw een bron van infectie zal worden.Het is noodzakelijk om een ​​viruskweek uit te voeren op klinische monsters en een "levend" virus te kweken om te bewijzen dat het besmettelijk is.

Samenvatting

Samengevat kunnen SARS-CoV-2-nucleïnezuurtests vals-negatieven, hertest-positieven en andere aandoeningen die niet consistent zijn met klinische manifestaties niet volledig worden vermeden.Bij daadwerkelijke screening en testen wordt aanbevolen om klinische symptomen, beeldvormende onderzoeken (CT) en experimenten te combineren Laboratoriumtestresultaten (nucleïnezuurtest + virusspecifieke antilichaamtest) voor een uitgebreide diagnose om gemiste diagnose en verkeerde diagnose te voorkomen.Als de testresultaten duidelijk inconsistent blijken te zijn met de klinische manifestaties, wordt aanbevolen om een ​​uitgebreide analyse uit te voeren van de volledige testlink (monsterverzameling, circulatie en verwerkingslinks) om vroege infectie met het SARS-CoV-2-virus, terugkerende infectie of gecombineerd met andere respiratoire virusinfecties, enz. mogelijk uit te sluiten.Als de omstandigheden het toelaten, wordt aanbevolen om meer gevoelige monsters zoals sputum of alveolaire lavagevloeistof te verzamelen voor heronderzoek.

Gerelateerde producten:

SARS-CoV-2 nucleïnezuurdetectiekit (Multiplex PCR Fluorescent Probe-methode)