• facebook
  • gelinkt
  • youtube

Traditionele reverse transcriptases kunnen geen hoge temperaturen verdragen (de optimale temperatuur voor MMLV-activiteit is 37-50°C en AMV is 42-60°C).Het meer complexe virale RNA kan bij lage temperaturen niet effectief omgekeerd worden getranscribeerd in cDNA, wat resulteert in detectie-efficiëntie.Traditionele RT-qPCR vereist over het algemeen de deelname van twee sleutelenzymen (reverse transcriptase en DNA-polymerase), wat het onmogelijk maakt om de werking van het reactiesysteem te vereenvoudigen en de kosten te verlagen.Hier introduceren we twee tegen hoge temperaturen resistente reverse transcriptases, TtH en RevTaq.Deze twee enzymen hebben ook de functie van DNA-polymerase, daarom worden ze bifunctionele enzymen genoemd.

TtH DNA-polymerase

Je hebt vast wel eens gehoord van TtH, dat is afgeleid van de thermofiele bacterie Thermus thermophilus HB8.In aanwezigheid van divalente kationen zoals Mg2+ heeft het DNA-polymerase-activiteit.Het wordt veel gebruikt in PCR-reacties zoals Taq-enzym, maar het heeft een hogere hittebestendigheid dan Taq-enzym, dus het heeft ook een beter effect op PCR met sjablonen met een hoog GC-gehalte.

· Dit enzym heeft eigenlijk geen 3′→5′ exonuclease-activiteit en 5′→3′ exonuclease-activiteit, dus het kan ook worden gebruikt voor dideoxy-sequencing.

· Dit enzym heeft RTase-activiteit.In aanwezigheid van Mn2+ zal de RTase-activiteit worden versterkt.Met behulp van deze functie kan het worden gebruikt om een ​​omgekeerde transcriptiereactie en een PCR-reactie uit te voeren in dezelfde buis, dat wil zeggen eenstaps RT-PCR.In de aanwezigheid van Mn2+ is de nauwkeurigheid van RT-PCR echter niet hoog.RT-activiteit heeft niets te maken met rnaase H-activiteit.

· De verhoogde activiteit van Tth-DNA-polymerase (pH9, optimaal +55℃~+70℃, maximaal +95℃) overwint de problemen die worden veroorzaakt door de secundaire RNA-structuur.Het resulterende cDNA kan worden geamplificeerd door middel van PCR met hetzelfde enzym in aanwezigheid van Mg2+-ionen.

· Het vermogen van Tth-DNA-polymerase om reverse transcriptie en DNA-amplificatie bij hoge temperaturen uit te voeren, maakt dit enzym bruikbaar voor kwantitatieve RT-PCR, klonering en genexpressie-analyse van cellulair en viraal RNA.
· Tth-DNA-polymerase wordt gebruikt voor RT-PCR om RNA tot 1 kb te amplificeren.

nul
 

Eigenschappen en voordelen

Tth DNA-polymerase:

• Zorg voor de geoptimaliseerde productgrootte van de polymerasekettingreactie (PCR), ten minste 1000 bp in de RT-PCR-reactie

• Accepteer gemodificeerd deoxyribonucleosidetrifosfaat als substraat

• Niet gerelateerd aan RNase H-activiteit

• Heeft een hoge thermische stabiliteit om problemen te overwinnen, meestal gerelateerd aan de hoge secundaire structuur die aanwezig is in RNA

RevTaq RT-PCR DNA-polymerase

Een hittebestendig DNA-polymerase met reverse transcriptase-activiteit

RevTaq-RT-PCR-DNA-polymerase is een gemanipuleerd, zeer hittebestendig, dubbelfunctioneel enzym met reverse transcriptase- en DNA-polymerase-activiteiten verkregen door gerichte en kunstmatige evolutie.

· De halfwaardetijd van RevTaq RT-PCR DNA-polymerase bij 95°C is langer dan 40 minuten.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymerase maakt reverse transcriptie bij hoge temperatuur rechtstreeks vanaf de RNA-template mogelijk, en de reverse transcriptiestap kan meerdere keren worden herhaald om meer cDNA-templates te genereren.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymerase maakt "zero-step" RT-PCR mogelijk (geen isotherme reverse transcriptiestap), omdat in de cyclische PCR-extensiestap reverse transcriptie en DNA-amplificatie gelijktijdig plaatsvinden.Dit bevordert ook de omgekeerde transcriptiereactie bij hoge temperaturen, waardoor de problemen bij het smelten van de sterke secundaire structuur in RNA bij hoge temperaturen worden geminimaliseerd.

· Dankzij de op aptameer gebaseerde hot-start-formule zal RevTaq RT-PCR DNA-polymerase betere resultaten opleveren wanneer de annealing- en extensietemperatuur hoger is dan 57°C.

· Aangezien het enzym hittebestendig is, wordt aanbevolen om primers en sondes te ontwerpen met zeer hoge smeltpunten (>60°C).

· Het wordt aanbevolen om de temperatuur van de annealing/extension-stap te optimaliseren door middel van een temperatuurgradiënt tijdens het opzetten van de reactie.

· Hoe hoger de temperatuur, hoe hoger de specificiteit van PCR.De omgekeerde transcriptiecyclus wordt meestal uitgevoerd bij een hogere temperatuur dan de PCR-cyclus, omdat DNA Primer:RNA Template-hybridisatie gewoonlijk een hoger smeltpunt heeft dan DNA Primer:cDNA Template-duplex.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymerase is genetisch gemanipuleerd en geoptimaliseerd, en de amplicongrootte ligt tussen 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNA-polymerasedetectielimiet bereikt 4 kopieën/Twee (2)

Het geoptimaliseerde reactiesysteem (het tot stand brengen van primers met een hoog smeltpunt) wordt getoond in de figuur.RevTaq RT-PCR DNA-polymerase-aangedreven RT-PCR vertoont een betere gevoeligheid dan de TaqPath 1-staps RT-qPCR-mastermix en een lagere verdunningsgradiënt voor detectiemonsters.

Meer voordelen:

Snelstartfunctie → De initiële thermische denaturatiestap kan worden overgeslagen.

Hot-start aptamer-formule → Biedt onmiddellijk 100% enzymactiviteit en voorkomt niet-specifieke amplificatie bij lage temperaturen (<57°C).

Splitsingsfunctie → De RNA-extractiestap wordt weggelaten, omdat RevTaq RT-PCR DNA-polymerase ook ruwe reactiemonsters kan verwerken.Het kan de celmembranen van eukaryoten, bacteriën en virussen onmiddellijk vernietigen in een hete RT-PCR-cyclus.

IVD grondstofniveau → hoge kwaliteitsnormen en uiterst scherpe prijzen


Posttijd: 12 aug. 2021