• facebook
  • gelinkt
  • youtube

Als nieuweling in het laboratorium is het niet prettig om positieve planten uit een bos planten met een lage conversie te filteren.Eerst moet uit een groot aantal monsters één voor één DNA worden geëxtraheerd, waarna met PCR de vreemde genen worden opgespoord.De resultaten zijn echter vaak blanco's en banden met af en toe een paar items, maar het is onmogelijk om te bepalen of er gemiste detecties of valse detecties zijn..Is het erg hulpeloos om zo'n experimenteel proces en resultaten onder ogen te zien?Maak je geen zorgen, Brother leert je hoe je gemakkelijk en nauwkeurig transgene positieve planten kunt screenen.

Stap 1

Ontwerp detectieprimers

Snel1

Bepaal het endogene gen en het exogene gen dat moet worden gedetecteerd volgens het te testen monster en selecteer een representatieve sequentie van 100-500 bp in het gen voor het ontwerp van de primer.Goede primers kunnen de nauwkeurigheid van de detectieresultaten waarborgen en de detectietijd verkorten (zie de bijlage voor veelgebruikte detectieprimers).

Opmerking: de nieuw ontworpen primers moeten de reactieomstandigheden optimaliseren en de nauwkeurigheid, precisie en detectielimiet van de detectie verifiëren voordat grootschalige detectie plaatsvindt.

Stap 2

Ontwerp experimenteel protocol

Snel2

Positieve controle: gebruik het gezuiverde DNA dat het doelfragment bevat als sjabloon om te bepalen of het PCR-reactiesysteem en de omstandigheden normaal zijn.

Negatieve/blanco controle: Gebruik de DNA-template of ddH2O die het doelfragment niet bevat als template om te detecteren of er een besmettingsbron in het PCR-systeem is.

Interne referentiecontrole: gebruik de primer/probe-combinatie van het endogene gen van het te testen monster om te evalueren of de template kan worden gedetecteerd met PCR.

Kennisgeving:

Voor elke test moeten positieve, negatieve/blanco controles en interne controlecontroles worden ingesteld om de validiteit van de experimentele resultaten te evalueren.

Experiment voorbereiding

Snel3

Controleer voor gebruik of de oplossing gelijkmatig gemengd is.Als er neerslag wordt gevonden, moet deze vóór gebruik worden opgelost en gemengd volgens de instructies.2 × PCR-mix moet voor gebruik worden gepipetteerd en herhaaldelijk worden gemengd met een micropipet om ongelijkmatige ionenverdeling te voorkomen.

Kennisgeving:

Haal de handleiding eruit en lees deze aandachtig en tref voorbereidingen voor het experiment in strikte overeenstemming met de vereisten van de handleiding.

Stap 4

Bereid het PCR-reactiesysteem voor

Snel4

Meng volgens het experimentele protocol de primers, H2O en 2×PCR gelijkmatig, centrifugeer en verdeel ze over elke reageerbuis.

Kennisgeving:

Voor grootschalige of langdurige testen wordt aanbevolen om een ​​PCR-reactiesysteem te gebruiken dat UNG-enzym bevat, dat aërosolverontreiniging veroorzaakt door PCR-producten effectief kan voorkomen.

Stap 5

Reactiesjabloon toevoegen

Snel5

Met behulp van Direct PCR-technologie is er geen moeizaam nucleïnezuurzuiveringsproces nodig, kan de monstersjabloon binnen 10 minuten worden bereid en kan het bijbehorende PCR-reactiesysteem worden toegevoegd.

Kennisgeving:

De splitsingsmethode heeft een beter detectie-effect en het verkregen product kan voor meerdere detectiereacties worden gebruikt.

Snel6

5.1: Directe expansie van bladeren

Snijd het bladweefsel met een diameter van 2-3 mm volgens de grootte van de afbeelding in de handleiding en plaats het in het PCR-reactiesysteem.

Opmerking: Zorg ervoor dat de bladfragmenten volledig zijn ondergedompeld in de PCR-reactieoplossing en voeg geen overtollig bladweefsel toe.

5.2: Leaf split-methode

Snijd het bladweefsel met een diameter van 5-7 mm en plaats het in een centrifugebuis.Als u volwassen bladeren kiest, vermijd dan het gebruik van de weefsels van de hoofdnerf van het blad.Pipetteer 50 µl Buffer P1-lysaat in een centrifugebuis om ervoor te zorgen dat het lysaat het bladweefsel volledig kan onderdompelen, plaats het in een thermische cycler of een metalen bad en lyseert bij 95°C gedurende 5-10 minuten.

Snel7

Voeg 50ul Buffer P2 neutralisatie-oplossing toe en meng goed.Het resulterende lysaat kan als template worden gebruikt en aan het PCR-reactiesysteem worden toegevoegd.

Opmerking: de hoeveelheid sjabloon ligt tussen 5-10% van het PCR-systeem en mag niet hoger zijn dan 20% (voeg bijvoorbeeld in een 20μl PCR-systeem 1-2μl lysisoplossing toe, niet meer dan 4μl).

Stap 6

PCR-reactie

Snel8

Na het centrifugeren van de PCR-reactiebuis wordt deze voor amplificatie in een PCR-instrument geplaatst.

Kennisgeving:

De reactie gebruikt niet-gezuiverde template voor amplificatie, dus het aantal amplificatiecycli is 5-10 cycli meer dan bij gebruik van gezuiverde DNA-template.

Stap 7

Elektroforesedetectie en resultaatanalyse

Snel9

M: 100 bp DNA-ladder

1\4: Gezuiverde DNA-methode

2\5: Directe PCR-methode

3\6: Blanco controle

QC:

De testresultaten van de verschillende in het experiment ingestelde controles dienen aan de volgende voorwaarden te voldoen.Anders moet de oorzaak van het probleem worden geanalyseerd en moet de test opnieuw worden uitgevoerd nadat het probleem is verholpen.

Tabel 1. Normale testresultaten van verschillende controlegroepen

*Als het plasmide als positieve controle wordt gebruikt, kan het resultaat van de endogene gentest negatief zijn

Resultaat oordeel:

A. Het testresultaat van het endogene gen van het monster is negatief, wat aangeeft dat het DNA dat geschikt is voor gewone PCR-detectie niet uit het monster kan worden gehaald of dat het geëxtraheerde DNA PCR-reactieremmers bevat en dat het DNA opnieuw moet worden geëxtraheerd.

B. Het testresultaat van het endogene gen van het monster is positief en het testresultaat van het exogene gen is negatief, wat aangeeft dat DNA dat geschikt is voor gewone PCR-detectie uit het monster wordt gehaald en kan worden beoordeeld dat het XXX-gen niet wordt gedetecteerd in het monster.

C. Het testresultaat van het endogene gen van het monster is positief en het testresultaat van het exogene gen is positief, wat aangeeft dat DNA dat geschikt is voor gewone PCR-detectie uit het monster is geëxtraheerd en dat het monster-DNA het XXX-gen bevat.Bevestigingsexperimenten kunnen verder worden uitgevoerd.

Stap 8

Ontwerp detectieprimers

Snel10

Gebruik na het experiment 2% natriumhypochlorietoplossing en 70% ethanoloplossing om het experimentele gebied af te vegen om milieuvervuiling te voorkomen.


Posttijd: 08-09-2021