COVID-19 is een besmettelijke ziekte die wordt veroorzaakt door het Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Type 2. Wanneer een persoon besmet is, zijn de meest voorkomende symptomen koorts, hoesten en kortademigheid.
De monsters die voor het testen worden gebruikt, kunnen worden verzameld met nasofaryngeale uitstrijkjes of orofaryngeale uitstrijkjes.
De standaardmethode voor detectie van coronavirus is de polymerasekettingreactie, PCR.Dit is een methode die veel wordt gebruikt in de moleculaire biologie.Het kan snel miljoenen tot miljarden specifieke DNA-fragmenten kopiëren.
Het nieuwe coronavirus bevat een zeer lang enkelstrengs RNA-genoom.Om deze virussen door PCR te detecteren, moeten RNA-moleculen worden omgezet in hun complementaire DNA-sequenties door middel van reverse transcriptase, waarna het nieuw gesynthetiseerde DNA kan worden geamplificeerd door middel van standaard PCR-procedures, die algemeen bekend staan als RT-PCR.
RT-PCR-proces
RNA-extractie
Om deze methode uit te voeren, moet in principe viraal RNA worden geëxtraheerd.Er kan een verscheidenheid aan RNA-zuiveringskits worden gebruikt voor gemakkelijke, snelle en effectieve scheiding.
Om viraal RNA te extraheren met behulp van een commerciële kit, voegt u eerst het monster toe aan een microcentrifugebuis en mengt u het vervolgens met de lysisbuffer.Deze buffer is sterk gedenatureerd en bestaat meestal uit fenol en guanidine-isothiocyanaat.Bovendien zijn RNase-remmers meestal aanwezig in de lysisbuffer om isolatie van intact viraal RNA te verzekeren.
Na het toevoegen van de lysisbuffer, vortex de mengbuis door puls en incubeer bij kamertemperatuur.Het virus wordt vervolgens gelyseerd onder sterk denaturerende omstandigheden die worden verschaft door de lysisbuffer.
Nadat het monster is gelyseerd, wordt een centrifugebuis gebruikt voor de zuiveringsprocedure.Het monster wordt in de centrifugebuis geladen en vervolgens gecentrifugeerd.
Deze procedure is een vastefase-extractiemethode waarbij de stationaire fase bestaat uit een silicagelmatrix.
Onder optimale zout- en pH-omstandigheden binden RNA-moleculen aan het silicamembraan.
Tegelijkertijd worden eiwitten en andere verontreinigingen verwijderd.
Plaats de centrifugebuis na het centrifugeren in een schone verzamelbuis, gooi het filtraat weg en voeg vervolgens wasbuffer toe.
Plaats de buis opnieuw in de centrifuge om de wasbuffer door het membraan te persen.Hierdoor worden alle resterende onzuiverheden van het membraan verwijderd, waardoor alleen het RNA aan de silicagel gebonden blijft.
Nadat het monster is gewassen, plaatst u de buis in een schone microcentrifugebuis en voegt u de elutiebuffer toe.
Vervolgens wordt het gecentrifugeerd om de elutiebuffer door het membraan te persen.De elutiebuffer verwijdert viraal RNA uit de spinkolom en verkrijgt gezuiverd RNA dat vrij is van eiwitten, remmers en andere verontreinigingen.
Gemengd concentraat
Na het extraheren van het virale RNA is de volgende stap het bereiden van het reactiemengsel voor PCR-amplificatie.In deze stap wordt concentraat gebruikt.Deze geconcentreerde oplossing is een voorgemengde geconcentreerde oplossing bestaande uit een premix, reverse transcriptase, nucleotiden, forward primer, reverse primer, TaqMan-probe en DNA-polymerase.
Ten slotte wordt om dit reactiemengsel te voltooien de RNA-template toegevoegd.De buisjes worden gemengd door middel van pulswerveling en vervolgens wordt het reactiemengsel in de PCR-plaat geladen.De PCR-plaat bevat meestal 96 wells en kan meerdere monsters tegelijkertijd analyseren.
PCR-amplificatie
Plaats vervolgens de plaat in de PCR-machine, die in wezen een thermische cycler is.
Realtime RT-PCR wordt gebruikt om het nieuwe coronavirus uit 2019 te detecteren door de doelsequentie in het RdrRP-gen, het E-gen en het N-gen te amplificeren.De keuze van het doelgen hangt af van de primer- en probesequentie.
De eerste stap van RT-PCR is reverse transcriptie.De eerste streng complementair DNA wordt gesynthetiseerd, die wordt geïnitieerd door de PCR reverse primer, die zich bindt aan het complementaire deel van het virale RNA-genoom.Vervolgens voegt reverse transcriptase DNA-nucleotiden toe aan het 3'-uiteinde van de primer om DNA te synthetiseren dat complementair is aan het virale RNA.De temperatuur en duur van deze stap zijn afhankelijk van de gebruikte primers, doel-RNA en reverse transcriptase.
Vervolgens wordt een initiële denaturatiestap toegepast, die resulteert in de denaturatie van de RNA-DNA-hybride.Deze stap is nodig om de DNA-polymerase te activeren.Tegelijkertijd wordt reverse transcriptase geïnactiveerd.
PCR bestaat uit een reeks thermische cycli.Elke cyclus bestaat uit stappen van denaturatie, annealing en extensie.
De denaturatiestap omvat het verwarmen van de reactiekamer tot 95 graden Celsius en het gebruik ervan voor denaturatie van de dubbelstrengige DNA-template.
In de volgende stap wordt de reactietemperatuur verlaagd tot 58 graden Celsius, waardoor de voorwaartse primer kan hechten aan het complementaire deel van zijn enkelstrengs DNA-template.De gloeitemperatuur is direct afhankelijk van de lengte en samenstelling van de primer.
In de verlengingsstap synthetiseert het DNA-polymerase een nieuwe DNA-streng die complementair is aan de DNA-templatestreng.Door vrije kernen toe te voegen die complementair zijn aan het sjabloon in de 5'-naar-3'-richting van het reactiemengsel.De temperatuur van deze stap hangt af van de gebruikte DNA-polymerase.
Na de eerste cyclus wordt een dubbelstrengig DNA-doelwit verkregen.
Voer vervolgens de tweede cyclus in.Het dubbelstrengs DNA wordt gedenatureerd om twee enkelstrengs DNA-moleculen te produceren.
In de volgende stap wordt de reactietemperatuur verlaagd, worden de primers gehybridiseerd aan elke enkelstrengs DNA-template en wordt de Taq-man-probe gehybridiseerd aan het complementaire deel van het doel-DNA.
De TaqMan-probe bestaat uit een fluorofoor die covalent is gekoppeld aan het 5'-uiteinde van de oligonucleotide-probe.Bij opwinding door de lichtbron van de fietser zendt de fluorofoor fluorescentie uit.Bovendien bestaat de sonde uit een quencher aan het 3'-uiteinde.De nabijheid van het reportergen tot de quencher verhindert de detectie van fluorescentie.
In de uitbreidingsstap synthetiseert het DNA-polymerase een nieuwe streng.Wanneer de polymerase de TaqMan-probe bereikt, splitst de endogene 5'-nuclease-activiteit de probe, waardoor de kleurstof van de quencher wordt gescheiden.
Bij elke PCR-cyclus komen er meer kleurstofmoleculen vrij, wat resulteert in een toename van de fluorescentie-intensiteit evenredig met het aantal gesynthetiseerde amplicons.
Deze methode maakt het mogelijk om het aantal van een bepaalde sequentie in het monster te schatten.Het aantal dubbelstrengige DNA-fragmenten verdubbelt in elke cyclus.Daarom kan PCR worden gebruikt om zeer kleine monsters te analyseren.
Voor het meten van fluorescentiesignalen, wolfraamhalogeenlampen, excitatiefilters, reflectoren, lenzen, emissiefilters en ladingsgekoppelde CCD-camera's.
STAP 4 Detecteren
Voor het meten van fluorescentiesignalen, wolfraamhalogeenlampen, excitatiefilters, reflectoren, lenzen, emissiefilters en ladingsgekoppelde CCD-camera's.
Het gefilterde licht van de lamp wordt gereflecteerd door de reflector, gaat door de condensorlens en wordt gefocust op het midden van elk gaatje.Vervolgens wordt de door het gat uitgezonden fluorescentie gereflecteerd door de spiegel, gaat door het emissiefilter en wordt gedetecteerd door de CCD-camera.In elke PCR-cyclus kan het zelfopgewekte fluorofoorlicht worden gedetecteerd door de CCD.
Het zet het opgevangen licht om in digitale gegevens.Deze methode wordt real-time PCR genoemd en maakt real-time monitoring van de voortgang van de PCR-reactie mogelijk.
Posttijd: 19 juli 2021