• facebook
  • gelinkt
  • youtube

Verschillende revolutionaire uitvindingen in de geschiedenis van de detectietechnologie zijn in mijn gedachten immunolabeling-technologie gebaseerd op het principe van antigeen-antilichaamspecifieke binding, PCR-technologie en sequencing-technologie.Vandaag zullen we het hebben over PCR-technologie.Volgens de evolutie van PCR-technologie verdelen mensen PCR-technologie gewoonlijk in drie generaties: gewone PCR-technologie, real-time fluorescerende kwantitatieve PCR-technologie en digitale PCR-technologie.

Cgebruikelijke PCR-techniek

w1

KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)

Kary Mullis vond in 1983 de polymerasekettingreactie (polymerasekettingreactie, PCR) uit. Er wordt gezegd dat hij tijdens het rijden met zijn vriendin plotseling een flits van inspiratie kreeg en dacht aan het principe van PCR (over de voordelen van autorijden).Kary Mullis ontving in 1993 de Nobelprijs voor scheikunde. The New York Times merkte op: "Zeer origineel en veelzeggend, waarbij de biologie bijna wordt verdeeld in pre-PCR- en post-PCR-tijdperken.

Het principe van PCR: onder de katalyse van DNA-polymerase wordt het moederstreng-DNA gebruikt als de sjabloon en wordt de specifieke primer gebruikt als het startpunt van verlenging, en wordt het dochterstreng-DNA complementair aan het moederstreng-sjabloon-DNA gekopieerd in vitro door denaturatie, annealing, extensie en andere stappen.Het is een in vitro amplificatietechnologie voor DNA-synthese, die elk doel-DNA in vitro snel en specifiek kan amplificeren.

w2

Voordelen van gewone PCR
1.Klassieke methode, volledige internationale en binnenlandse normen
2.Lagere kosten van instrumentreagentia
3.PCR-producten kunnen worden teruggewonnen voor andere moleculaire biologische experimenten
Aanbevolen Foregene PCR-machine: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Gerelateerde producten: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Nadelen van gewone PCR
1.makkelijk te vervuilen
2.omslachtige bediening
3.alleen kwalitatieve analyse
4.Matige gevoeligheid
5.Er is niet-specifieke versterking en wanneer de niet-specifieke band even groot is als de doelband, kan deze niet worden onderscheiden
 
Cop apillaire elektroforese gebaseerde PCR
Als reactie op de tekortkomingen van gewone PCR hebben sommige fabrikanten instrumenten geïntroduceerd die gebaseerd zijn op het principe van capillaire elektroforese.De elektroforesestap na PCR-amplificatie is voltooid in het capillair.De gevoeligheid is hoger, en het verschil van verschillende basen kan worden onderscheiden en de versterking kan door MAERKER worden berekend.productinhoud.Het nadeel is dat het PCR-product nog moet worden geopend en in het instrument moet worden gedaan en dat er nog steeds een groot risico op verontreiniging bestaat.

w3

CbijpilaarEelektroforese

 

2. Real-time fluorescerende kwantitatieve PCR-technologie (Quantitative Real-time PCR, qPCR).Fluorescente kwantitatieve PCR, ook wel Real-Time PCR genoemd, is een nieuwe nucleïnezuur kwantitatieve technologie ontwikkeld door PE (Perkin Elmer) in 1995. De ontwikkelingsgeschiedenis van fluorescente kwantitatieve PCR is een geschiedenis van zielsopwindende strijd van giganten zoals ABI, Roche , en BioRad.Als je geïnteresseerd bent, kun je het bekijken.Deze techniek is momenteel de meest ontwikkelde en meest gebruikte semi-kwantitatieve PCR-techniek.

Aanbevolen qPCR-machine: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/

Fluorescerende verfmethode (SYBR Green I):SYBR Green I is de meest gebruikte DNA-bindende kleurstof voor kwantitatieve PCR, die niet-specifiek bindt aan dubbelstrengig DNA.In de vrije toestand straalt SYBR Green zwakke fluorescentie uit, maar eenmaal gebonden aan dubbelstrengig DNA, neemt de fluorescentie 1000 keer toe.Daarom is het totale fluorescentiesignaal dat door een reactie wordt uitgezonden evenredig met de hoeveelheid dubbelstrengs DNA die aanwezig is en zal toenemen met de toename van het geamplificeerde product.Aangezien de kleurstof niet-specifiek bindt aan dubbelstrengs DNA, kunnen fout-positieve resultaten worden gegenereerd.

Gerelateerde producten: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/

Methode met fluorescerende sonde (Taqman-technologie): TijdensPCR-amplificatie, een specifieke fluorescerende sonde wordt tegelijk met een paar primers toegevoegd.De probe is een lineair oligonucleotide, met aan beide uiteinden respectievelijk een fluorescerende reportergroep en een fluorescerende uitdovingsgroep gemerkt.Wanneer de sonde intact is, wordt het fluorescerende signaal uitgezonden door de reportergroep geabsorbeerd door de quenchergroep en de detectie Er is geen fluorescerend signaal;tijdens PCR-amplificatie (in de uitbreidingsfase) zal de 5'-3' Dicer-activiteit van het Taq-enzym de sonde verteren en degraderen, zodat de reporter-fluorescentiegroep en de quencher-fluorescentiegroep worden gescheiden, zodat het fluorescentiebewakingssysteem de fluorescerende signaal kan worden ontvangen, dat wil zeggen, elke keer dat een DNA-keten wordt versterkt, wordt een fluorescerend molecuul gevormd, dat de volledige synchronisatie van de accumulatie van fluorescerende signalen en de vorming van PCR-producten realiseert.De Taqman-sondemethode is de meest gebruikte detectiemethode bij klinische detectie.

Gerelateerde producten: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/

w4

Voordelen van qPCR
1.De methode is volwassen en de ondersteunende apparatuur en reagentia zijn compleet
2.Gemiddelde kosten van reagentia
3.makkelijk te gebruiken
4.Hoge detectiegevoeligheid en specificiteit
 
Nadelen van qPCR

De mutatie van het doelgen leidt tot gemiste detectie.
Het detectieresultaat van sjabloon met lage concentratie kan niet worden bepaald.
Er is een grote fout bij het gebruik van de standaardcurve voor kwantitatieve detectie.
 
3. Digitale PCR-technologie (digitale PCR, dPCR).
Digitale PCR is een techniek voor de absolute kwantificering van nucleïnezuurmoleculen.In vergelijking met qPCR kan digitale PCR direct het aantal DNA/RNA-moleculen lezen, wat de absolute kwantificering is van nucleïnezuurmoleculen in het uitgangsmonster.In 1999 stelden Bert Vogelstein en Kenneth W. Kin-zler formeel het concept van dPCR voor.
 
In 2006 was Fluidigm de eerste die een commercieel chipgebaseerd dPCR-instrument produceerde.In 2009 lanceerde Life Technologies de OpenArray en QuantStudio 12K Flex dPCR-systemen.In 2013 lanceerde Life Technologies het QuantStudio 3DdPCR-systeem, dat microfluïdische chiptechnologie met hoge dichtheid op nanoschaal gebruikt om monsters gelijkmatig te verdelen over 20.000 individuele cellen.in de reactie goed.

w5

In 2011 lanceerde Bio-Rad het op druppels gebaseerde QX100 dPCR-instrument, dat water-in-olie-technologie gebruikt om het monster gelijkmatig te verdelen over 20.000 druppels water-in-olie, en een druppelanalysator gebruikt om de druppels te analyseren.In 2012 lanceerde RainDance het RainDrop dPCR-instrument, aangedreven door gas onder hoge druk, om elk standaard reactiesysteem te verdelen in een reactie-emulsie die 1 miljoen tot 10 miljoen microdruppeltjes op picoliterniveau bevat.

w6

Tot nu toe heeft digitale PCR twee belangrijke facties gevormd, het type chip en het type druppel.Het maakt niet uit wat voor soort digitale PCR, de kernprincipes ervan zijn beperkende verdunning, eindpunt-PCR en Poisson-distributie.Het standaard PCR-reactiesysteem dat nucleïnezuurtemplates bevat, is gelijkmatig verdeeld in tienduizenden PCR-reacties, die worden verdeeld over chips of microdruppels, zodat elke reactie zoveel mogelijk een templatemolecuul bevat en een PCR-reactie met een enkel molecuul is uitgevoerd.Door de fluorescentie te lezen wordt de aan- of afwezigheid van het signaal geteld en de absolute kwantificering wordt uitgevoerd na kalibratie van de statistische Poisson-verdeling.

Hieronder volgen de kenmerken van verschillende digitale PCR-platforms die ik heb gebruikt:

1. Bio-Rad QX200 druppel digitale PCR Bio-RadQX200 is een heel klassiek digitaal PCR-platform, het basisdetectieproces: 20.000 monsters worden gegenereerd door de druppelgenerator Water-in-olie microdruppeltjes worden versterkt op een gewone PCR-machine en uiteindelijk wordt het fluorescentiesignaal van elke microdruppel gelezen door een microdruppellezer.De operatie is ingewikkelder en het risico op vervuiling is gemiddeld.

w7

Xinyi TD1 micro-druppel digitale PCRXinyi TD1 is een binnenlands digitaal PCR-platform, het basisdetectieproces: genereer 30.000-50.000 water-in-olie-druppeltjes via een druppelgenerator, versterk op een gemeenschappelijk PCR-instrument en passeer uiteindelijk De druppellezer leest het fluorescerende signaal van elke druppel.Zowel het genereren als lezen van druppels in dit platform wordt uitgevoerd in een speciale chip met een laag besmettingsrisico.

w8

 STILLA Naica digitale PCR met microdruppelchipSTILLA Naica is een relatief nieuw digitaal PCR-platform.Het basisdetectieproces is: voeg de reactieoplossing toe aan de chip, plaats de chip in het systeem voor het genereren en versterken van microdruppeltjes en genereer 30.000 microdruppeltjes.Verspreid over de chip en PCR-amplificatie wordt voltooid op de chip.Vervolgens wordt de versterkte chip overgebracht naar het analysesysteem voor het lezen van microdruppels en wordt het fluorescerende signaal gelezen door foto's te maken.Doordat het hele proces in een gesloten chip plaatsvindt, is de kans op besmetting klein.

w9

4. ThermoFisher QuantStudio 3D-chip digitale PCR

ThermoFisher QuantStudio 3D is een ander klassiek chipgebaseerd digitaal PCR-platform.Het basisdetectieproces is: voeg de reactieoplossing toe aan de strooier en verdeel de reactieoplossing gelijkmatig over de chip met 20.000 microwells door de strooier., plaats de chip op de PCR-machine om te versterken, plaats de chip uiteindelijk in de lezer en maak een foto om het fluorescerende signaal te lezen.De operatie is relatief ingewikkeld, het hele proces wordt uitgevoerd in een gesloten chip en de kans op besmetting is laag.

w10

5. JN MEDSYS Clarity-chip digitale PCR

JN MEDSYS Clarity is een relatief nieuw digitaal PCR-platform van het chiptype.Het basisdetectieproces is: voeg de reactieoplossing toe aan de applicator en verdeel de reactieoplossing gelijkmatig over 10.000 PCR-buisjes die via de applicator in de PCR-buis zijn bevestigd.Op de microporeuze chip komt de reactieoplossing de chip binnen via capillaire werking, en de PCR-buis met de chip wordt op de PCR-machine geplaatst voor versterking, en ten slotte wordt de chip in de lezer geplaatst om het fluorescerende signaal te lezen door een foto te maken.De operatie is ingewikkelder.Het risico op besmetting is laag.

w11

De parameters van elk digitaal PCR-platform zijn als volgt samengevat:

w12

De evaluatie-indicatoren van het digitale PCR-platform zijn: het aantal split units, het aantal fluorescentiekanalen, de complexiteit van de operatie en het risico op besmetting.Maar het belangrijkste is de detectienauwkeurigheid.Een manier om digitale PCR-platforms te evalueren is om meerdere digitale PCR-platforms te gebruiken om elkaar te verifiëren, en een andere manier is om standaardstoffen met nauwkeurige waarden te gebruiken.

Voordelen van dPCR
1.Het bereiken van absolute kwantificering
2.Hogere sensitiviteit en specificiteit
3.Kan monsters met weinig kopieën detecteren
Nadelen van dPCR1. Dure apparatuur en reagentia 2. Ingewikkelde werking en lange detectietijd 3. Smal detectiebereik

Op dit moment hebben de drie generaties PCR-technologie hun eigen voor- en nadelen, en elk heeft zijn eigen toepassingsgebieden, en het is geen relatie dat de ene generatie de andere vervangt.De voortdurende vooruitgang van de technologie heeft de PCR-technologie nieuw leven ingeblazen, waardoor de ene toepassingsrichting na de andere kan worden ontgrendeld, waardoor nucleïnezuurdetectie gemakkelijker en nauwkeuriger wordt.
Bron: Dr. Yuan neemt je mee voor testen
 
Aangeraden producten:


Posttijd: 18-nov-2022