PCR is de meest gebruikte nucleïnezuuramplificatietechnologie en wordt veel gebruikt vanwege zijn gevoeligheid en specificiteit.PCR vereist echter herhaalde thermische denaturatie en kan de beperkingen van het vertrouwen op instrumenten en apparatuur, die de toepassing ervan in klinische veldtesten beperkt, niet wegnemen.

Sinds het begin van de jaren negentig zijn veel laboratoria begonnen met het ontwikkelen van versterkingstechnologie bij constante temperatuur die geen thermische denaturatie vereist.Nu hebben ze lus-gemedieerde isotherme amplificatietechnologie, isotherme amplificatietechnologie voor strengvervanging, isotherme amplificatietechnologie met rollende cirkel en afhankelijkheid van nucleïnezuursequenties ontwikkeld.Isotherme versterkingstechnologie en andere technologieën. 

Loop-gemedieerde isotherme amplificatie

Het amplificatieprincipe is gebaseerd op het feit dat DNA zich in een dynamische evenwichtstoestand bevindt bij ongeveer 65°C.Wanneer een primer een basenparing heeft en zich uitstrekt tot het complementaire deel van dubbelstrengs DNA, zal de andere streng dissociëren en enkelstrengs worden.

Bij deze temperatuur gebruikt DNA 4 specifieke primers om te vertrouwen op een DNA-polymerase met strengverplaatsing om de synthese van DNA met strengverplaatsing continu zelf te laten circuleren.

Bepaal eerst de 6 specifieke regio's F3, F2, F1, B1, B2, B3 op het doelgen en ontwerp vervolgens 4 primers op basis van deze 6 specifieke regio's (zoals weergegeven in de onderstaande afbeelding):

De voorwaartse binnenprimer (FIP) is samengesteld uit F1c en F2.

De achterwaartse binnenprimer (BIP) is samengesteld uit B1c en B2, en TTTT wordt gebruikt als afstandhouder in het midden.

De buitenste primers F3 en B3 zijn respectievelijk samengesteld uit F3- en B3-gebieden op het doelgen.

In het LAMP-reactiesysteem is de concentratie van de binnenste primer meerdere malen die van de buitenste primer.De binnenste primer wordt eerst gecombineerd met de matrijsstreng om een ​​complementaire streng te synthetiseren om een ​​dubbele DNA-streng te vormen.Vervolgens wordt de buitenste primer gecombineerd met de matrijsstreng om een ​​dubbele DNA-streng te vormen.Onder invloed van BstDNA-polymerase wordt de complementaire streng gesynthetiseerd door de binnenste primer vrijgegeven.Na een reeks reacties vormt de complementaire streng uiteindelijk een enkele DNA-streng met een halterstructuur.

De enkele streng van het DNA van de halterstructuur zelf wordt gebruikt als een sjabloon om continu een DNA met een overgangsstam-lusstructuur met een open uiteinde te vormen.De binnenste en buitenste primers leiden het DNA van de overgangsstam-lusstructuur om continu strengverplaatsings- en verlengingsreacties te ondergaan en uiteindelijk meerdere stamlusstructuren met verschillende lengtes te vormen.DNA-mengsel.

Voor- en nadelen van lus-gemedieerde isotherme versterking

Voordelen van LAMP:

(1) Hoge amplificatie-efficiëntie, die effectief 1-10 kopieën van het doelgen binnen 1 uur kan versterken, en de amplificatie-efficiëntie is 10-100 keer die van gewone PCR.

(2) De reactietijd is kort, de specificiteit is sterk en er is geen speciale uitrusting vereist.

Tekortkomingen van LAMP:

(1) De eisen aan primers zijn bijzonder hoog.

(2) Het geamplificeerde product kan niet worden gebruikt voor klonen en sequencing, maar kan alleen worden gebruikt voor beoordeling.

(3) Vanwege de sterke gevoeligheid is het gemakkelijk om aerosolen te vormen, waardoor valse positieven worden veroorzaakt en de testresultaten worden beïnvloed.

Strand verplaatsingsversterking

Streng verplaatsingsamplificatie (SDA) is een in vitro isotherme DNA-amplificatietechniek gebaseerd op enzymatische reactie die voor het eerst werd voorgesteld door de Amerikaanse geleerde Walker in 1992.

Het basissysteem van SDA omvat een restrictie-endonuclease, een DNA-polymerase met strengverdringingsactiviteit, twee paar primers, dNTP's en calcium- en magnesiumionen en buffersystemen.

Het principe van strengverplaatsingsamplificatie is gebaseerd op de chemisch gemodificeerde restrictie-endonucleaseherkenningssequentie aan beide uiteinden van het doel-DNA.De endonuclease opent de opening in de DNA-streng op de herkenningsplaats, en de DNA-polymerase verlengt de opening 3' End en vervangt de volgende DNA-streng.

De vervangen enkele DNA-strengen kunnen worden gecombineerd met primers en door DNA-polymerase worden verlengd tot dubbele strengen.Dit proces wordt continu herhaald, zodat de doelsequentie efficiënt wordt geamplificeerd.

Voor- en nadelen van bundelverplaatsingsversterkingstechnologie

Voordelen van SDA:

De versterkingsefficiëntie is hoog, de reactietijd is kort, de specificiteit is sterk en er is geen speciale apparatuur vereist.

Tekortkomingen van SDA:

De producten zijn niet uniform en sommige enkelstrengs en dubbelstrengs producten worden altijd geproduceerd in de SDA-cyclus, en er zal onvermijdelijk staartvorming optreden wanneer ze worden gedetecteerd door elektroforese.

Rolling cirkelversterking

Rolling circle amplification (RCA) wordt voorgesteld door gebruik te maken van de methode om DNA van pathogene organismen te kopiëren door middel van een rollende cirkel.Het verwijst naar het gebruik van enkelstrengs circulair DNA als een sjabloon bij een constante temperatuur, en een speciaal DNA-polymerase (zoals Phi29)) Onder invloed van rollende cirkel-DNA-synthese om de amplificatie van het doelgen te bereiken.

RCA kan worden onderverdeeld in lineaire versterking en exponentiële versterking.De efficiëntie van lineaire RCA kan oplopen tot 10⁵keer, en de efficiëntie van exponentiële RCA kan oplopen tot 10⁹keer.

Eenvoudig onderscheid, zoals weergegeven in onderstaande figuur, lineaire amplificatie a gebruikt slechts 1 primer, exponentiële amplificatie b heeft 2 primers.

Lineaire RCA wordt ook single primer RCA genoemd.Een primer bindt zich aan circulair DNA en wordt verlengd door de werking van DNA-polymerase.Het product is een lineaire enkele streng met een groot aantal zich herhalende sequenties die duizenden keren de lengte van een enkele lus zijn.

Aangezien het product van lineaire RCA altijd verbonden is met de startprimer, is de gemakkelijke fixatie van het signaal een groot voordeel.

Exponentiële RCA, ook bekend als Hyper-vertakte amplificatie HRCA (Hyper-vertakte RCA), in exponentiële RCA, één primer versterkt het RCA-product, de tweede primer hybridiseert met het RCA-product en verlengt, en de vervanging is al gebonden aan het RCA-product. De stroomafwaartse primers verlengen de streng en herhalen de verlenging en vervanging om een ​​dendritisch RCA-amplificatieproduct te produceren.

De voor- en nadelen van nucleïnezuuramplificatie met rollende cirkel

Voordelen van RCA:

Hoge gevoeligheid, goede specificiteit en eenvoudige bediening.

Tekortkomingen van RCA:

Achtergrondproblemen tijdens signaaldetectie.Tijdens de RCA-reactie kunnen de niet-gecirculeerde hangslotprobe en het template-DNA of RNA van de ongebonden probe enkele achtergrondsignalen genereren. 

NOp nucleïnezuur gebaseerde amplificatie

Nucleïnezuursequentiegebaseerde amplificatie (NASBA) is een nieuwe technologie die is ontwikkeld op basis van PCR.Het is een continue en isotherme nucleïnezuuramplificatie geleid door een paar primers met een T7-promotersequentie.De technologie kan het sjabloon-RNA ongeveer 109 keer versterken in ongeveer 2 uur, wat 1000 keer hoger is dan de conventionele PCR-methode en er is geen speciale apparatuur voor nodig.

Deze technologie is gebruikt voor een snelle diagnose van ziekten zodra deze opdoken, en veel bedrijven gebruiken deze methode momenteel in RNA-detectiekits.

Hoewel RNA-amplificatie ook gebruik kan maken van reverse transcriptie PCR-technologie, heeft NASBA zijn eigen voordelen: het kan worden uitgevoerd onder relatief constante temperatuuromstandigheden en het is stabieler en nauwkeuriger dan traditionele PCR-technologie.

De reactie is bij 41 graden Celsius en vereist AMV (avian myeloblastosis virus) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA-polymerase en een paar primers om te voltooien.

Het proces omvat voornamelijk:

De voorwaartse primer bevat de complementaire sequentie van de T7-promoter.Tijdens de reactie bindt de voorwaartse primer aan de RNA-streng en wordt gekatalyseerd door het AMV-enzym om een ​​dubbele DNA-RNA-streng te vormen.

RNase H verteert het RNA in de hybride dubbelstrengs en behoudt het enkelstrengs DNA.

Onder invloed van de reverse primer en het AMV-enzym wordt een dubbele DNA-streng gevormd die de T7-promotersequentie bevat.

Onder invloed van T7 RNA-polymerase wordt het transcriptieproces voltooid en wordt een grote hoeveelheid doel-RNA geproduceerd.

Voordelen NASBA:

(1) De primer heeft een T7-promotorsequentie, maar het vreemde dubbelstrengs DNA heeft geen T7-promotorsequentie en kan niet worden geamplificeerd, dus deze technologie heeft een hoge specificiteit en gevoeligheid.

(2) NASBA neemt het omgekeerde transcriptieproces rechtstreeks op in de amplificatiereactie, waardoor de reactietijd wordt verkort.

Nadelen van NASBA:

(1) De reactiecomponenten zijn ingewikkelder.

(2) Er zijn drie soorten enzymen nodig om de reactiekosten hoger te maken.