1. Detecteer de absorptie van RNA-oplossing
Absorptie bij 280, 320, 230 en 260 nm vertegenwoordigt respectievelijk de waarden van nucleïnezuur, achtergrond (troebelheid van de oplossing), zoutconcentratie en organisch materiaal zoals eiwit.Kijk over het algemeen alleen naar OD260/OD280 (Ratio, R).Wanneer 1,8 ~ 2,0, denken we dat de verontreiniging van eiwit of ander organisch materiaal in RNA kan worden getolereerd, maar er moet worden opgemerkt dat wanneer Tris wordt gebruikt als buffer om de absorptie te detecteren, de R-waarde groter kan zijn dan 2 (over het algemeen zou het <2,2 moeten zijn).Wanneer R<1.8, is de vervuiling van eiwit of ander organisch materiaal in de oplossing duidelijker en kan het lot van het RNA worden bepaald op basis van de behoeften.Wanneer R>2.2, betekent dit dat RNA is gehydrolyseerd tot een enkel nucleïnezuur.
2. Elektroforetisch patroon van RNA
Over het algemeen wordt denaturerende gel gebruikt voor RNA-elektroforese, maar als het alleen is om de kwaliteit van RNA te detecteren, is denaturerende gel niet nodig en kan gewone agarosegel worden gebruikt.Het doel van elektroforese is het detecteren van de integriteit van 28S- en 18S-banden en hun verhouding, of de integriteit van mRNA-uitstrijkjes.Over het algemeen, als de 28S- en 18S-banden helder, helder en scherp zijn (verwijzend naar de randen van de banden zijn duidelijk), en de helderheid van 28S is meer dan het dubbele van die van de 18S-band, beschouwen we de kwaliteit van het RNA als goed.
Bovenstaande zijn de twee methoden die we gewoonlijk gebruiken, maar geen van deze twee methoden kan ons duidelijk vertellen of er resterend RNase in de RNA-oplossing zit.Als er een zeer kleine hoeveelheid RNase in de oplossing zit, is het voor ons moeilijk om het met de bovenstaande methode te detecteren, maar de meeste daaropvolgende enzymatische reacties worden uitgevoerd bij temperaturen boven de 37 graden en gedurende een lange tijd.Op deze manier, als er een zeer kleine hoeveelheid RNase in de RNA-oplossing zit, zal er een zeer geschikte omgeving en tijd zijn om hun rol te spelen in de daaropvolgende experimenten, en natuurlijk zal het experiment op dit moment koud zijn.Hieronder introduceren we een methode die kan bevestigen of er achtergebleven RNase in de RNA-oplossing zit.
3. Warmtebehoudtest
Trek, afhankelijk van de monsterconcentratie, twee 1000 ng RNA uit de RNA-oplossing en voeg deze toe aan een centrifugebuis van 0,5 ml, en vul deze aan met pH 7,0 Tris-buffer tot een totaal volume van 10 µl, en sluit vervolgens de dop van de buis.Plaats een ervan in een waterbad met constante temperatuur van 70°C en houd het gedurende 1 uur warm.Het andere deel werd gedurende 1 uur in een koelkast van -20°C bewaard.Als de tijd om is, verwijdert u de twee monsters voor elektroforese.Nadat de elektroforese is voltooid, vergelijkt u de elektroforetische banden van de twee.Als de banden van de twee consistent zijn of geen significant verschil hebben (hun banden voldoen natuurlijk ook aan de voorwaarden in methode 2), betekent dit dat er geen resterende RNase-verontreiniging in de RNA-oplossing is en dat de kwaliteit van het RNA erg goed is.Integendeel, als het bij 70°C geïncubeerde monster duidelijke afbraak vertoont, geeft dit aan dat er RNase-besmetting in de RNA-oplossing is.
2 Experimentele methoden en technieken voor RNA-extractie
De problemen die we vaak tegenkomen bij het extraheren van RNA zijn: (1) RNA-opbrengst is laag;(2) RNA heeft ernstige zoutverontreiniging;(3) RNA heeft ernstige organische oplosmiddelverontreiniging;(4) degradatie van monsters en andere problemen
1. Veelgebruikte reagentia voor totale RNA-extractie
De guanidine-isothiocyanaatmethode en de Trizol-methode zijn de meest gebruikte methoden voor de extractie van totaal RNA uit dierlijke weefsels en dierlijke cellen.Het is vooral geschikt voor kleine monsters en weefsels die bijzonder moeilijk te extraheren zijn, zoals de extractie van totaal RNA uit konijnenhuid en dierlijk bindweefsel;daarnaast kan Trizol, als lysisreagens voor algemeen gebruik, ook worden gebruikt voor de extractie van plantenweefsels, bacteriën, schimmels en andere weefsels.Voor plantenweefsels die polysacchariden en polyfenolen bevatten, zoals camellia oleifera, theebladeren, raapzaad etc., kan de CTAB-methode ook gebruikt worden om totaal RNA te extraheren.
Als conventionele methode is de methode met twee kolommen ook erg populair vanwege de werking bij normale temperatuur, het niet nodig is om RNase toe te voegen en veiligheid - geen chloroform, fenolen en andere organische reagentia voor extractie.(aangeraden producten )
2. Extractie van totaal RNA uit dierlijke weefsels
(1) Probeer vers weefsel te kiezen, als het niet vers is (bij voorkeur binnen drie maanden - 80 ℃ koelkast of ingevroren in vloeibare stikstof. Wanneer u weefsel snijdt, niet direct bij kamertemperatuur snijden, zorg ervoor dat u het op de ijsbox legt, probeer herhaaldelijk invriezen en ontdooien te voorkomen.
(2) Gebruik een schone schaar en een pincet om een klein stukje weefsel te knippen, probeer het centrale deel van het weefsel te snijden bij het snijden van het monster, of knip eerst het grote stuk weefsel uit het midden en knip het monster vervolgens bij de verse incisie positie.Het verwijderde weefsel moet volledig worden versnipperd, het versnipperde weefsel moet in een EP-buis zonder RNase worden gedaan, het lysaat moet worden toegevoegd, het versnipperde weefsel moet volledig worden blootgesteld aan het lysaat en het moet worden voorbereid op homogenisatie.
(3) Selecteer voor normale weefsels weefsels ter grootte van een mungboon (30-60 mg) voor homogenisatie.Als de weefsels een grote hoeveelheid eiwit, vet of dicht vezelig weefsel zoals lever bevatten, verhoog of verlaag dan op gepaste wijze de hoeveelheid gesneden weefsel (optioneel) Kies 10~20 mg).
(4) Als visspieren, garnalenvlees, kwallen en andere weefsels met een hoog watergehalte worden geëxtraheerd, moet het monstervolume op passende wijze worden vergroot (aanbevolen 100-200 mg).
(5) Als de omstandigheden het toelaten, kan het dierlijke weefsel direct worden geëxtraheerd nadat het is gehomogeniseerd met een high-passage weefselhomogenisator, als dergelijke apparatuur niet aanwezig is.
(6) Het RNA dat na de laatste extractie wordt verkregen, moet onmiddellijk op de ijsbox worden geplaatst om de afbraak van RNA te verminderen.
3. RNA-extractie van dierlijke cellen
(1) Suspensiecellen: centrifugeer direct en gooi het medium weg, was 1-2 keer met steriel PBS, suspendeer vervolgens met een geschikte hoeveelheid PBS en voeg dan lysaat toe voor lysis.Voeg het lysaat niet rechtstreeks toe aan de geprecipiteerde cellen nadat de vloeistof volledig is weggegooid.Hierdoor zal het histonpakket dat vrijkomt na de gelyseerde cellen op de buitenste laag zich hechten aan de buitenkant van de geprecipiteerde cellen, waardoor het contact van de cellen in de pellet met het lysaat wordt beperkt., resulterend in onvolledige cellysis en verminderde RNA-opbrengst.
(2) Cellen die semi-adherent of niet goed hechtend zijn: na het weggooien van het medium, 1-2 keer wassen met PBS, dan direct een geschikte hoeveelheid PBS absorberen en de kweekschaal blazen met een pipet of pistool om de cellen af te blazen, en breng ze over naar RNA-vrije cellen.Voeg het lysaat toe aan de EP-buis van het enzym voor extractie.
(3) Hechtende cellen: moeten eerst worden verteerd met trypsine, vervolgens worden verzameld in RNase-vrije EP-buisjes, gecentrifugeerd om het supernatant te verwijderen, 1-2 keer gewassen met PBS om overtollig trypsine te verwijderen, en opnieuw gesuspendeerd met een geschikte hoeveelheid PBS Ga vervolgens verder met de extractiestap.
4. Plant-RNA-extractie
Plantenweefsels zijn rijk aan fenolische verbindingen, of rijk aan polysacchariden, of bevatten een aantal niet-geïdentificeerde secundaire metabolieten, of hebben een hoge activiteit van RNase.Deze stoffen worden na cellysis nauw gecombineerd met RNA om onoplosbare complexen of colloïdale neerslagen te vormen, die moeilijk te verwijderen zijn.Daarom moeten we bij het extraheren van plantenweefsel een kit voor planten kiezen.Het lysaat in de kit kan de problemen van gemakkelijke oxidatie van polyfenolen en scheiding van polysaccharideverbindingen en nucleïnezuren effectief oplossen.
(Voor extractie van polysaccharide polyfenol planten-RNA, aanbevolen producten:
(1) De schil, pulp, zaden, bladeren, enz. van de plant moeten volledig worden gemalen in een vijzel.Tijdens het maalproces moet vloeibare stikstof tijdig worden bijgevuld om smelten van het monster te voorkomen.Het grondmonster moet snel aan het lysaat worden toegevoegd en geschud om RNA-afbraak te voorkomen.
(2) Voor vezelrijke monsters, zoals rijst- en tarwebladeren, moet de hoeveelheid extractie op passende wijze worden verminderd, anders zal het weefselvermaling en de lysis niet volledig zijn, wat resulteert in een lage opbrengst aan geëxtraheerd RNA.
(3) Voor plantenweefsels met een hoog watergehalte, zoals granaatappelfruit, watermeloenfruit, perzikfruit, enz., moet de steekproefomvang op passende wijze worden vergroot (100-200 mg is optioneel).
(4) Voor plantenweefsels, zoals bladeren van planten, wortelstokken, hard fruit en andere materialen wordt over het algemeen aanbevolen om vloeibare stikstof te gebruiken om de ingrediënten grondig in een vijzel te mortelen, en ga dan verder met de extractiestap.Conventionele weefselhomogenisatoren zijn mogelijk niet effectief bij het homogeniseren van plantenweefsels en worden over het algemeen niet aanbevolen.
5. Voorzorgsmaatregelen voor RNA-extractie
(1) Weefselmonsters moeten zo vers mogelijk zijn om herhaald invriezen en ontdooien te voorkomen.
(2) Het weefsel moet tijdens extractie volledig worden vermalen en de hoeveelheid weefsel mag niet te klein zijn, laat staan te veel.
(3) Er moet voldoende incubatietijd worden gegeven na toevoeging van het lysaat om het monster volledig te lyseren.
(4) Bij gebruik van de Trizol-methode voor extractie is het principe van het absorberen van het supernatant na stratificatie "liever minder inademen dan meer inademen", en mag niet naar de middelste laag extraheren, anders zal dit ernstige genomische DNA-verontreiniging veroorzaken.
(5) Tijdens het wassen moet de wasvloeistof volledig rond de buiswand infiltreren om een grondige wasbeurt te garanderen.
(6) Voor de kolomextractiemethode moet de adsorptiekolom, naast het losmaken van de kolom na het wassen, ook in een ultraschone bank worden geplaatst en gedurende 5-10 minuten worden geblazen om het organische oplosmiddel volledig te verdampen tot droog.
(7) Bij de laatste elutie van de kolommethode, na toevoeging van DEPC-water, moet het gedurende 3-5 minuten worden geïncubeerd, of het DEPC-water moet van tevoren worden verwarmd tot 60°C om de elutieopbrengst te verhogen.Bij de traditionele Trizol-splitsings- en isopropanolprecipitatiemethode wordt het uiteindelijke RNA opgelost in DEPC-water, dus er moet een geschikte tijd worden gegeven voor het oplossen, en de bodem van de centrifugebuis moet continu worden geblazen met een pipetpunt.
3 Tdrie Oorzaken en oplossingen voor lage RNA-concentratie/slechte kwaliteit
1. De opbrengst is te laag
Het geëxtraheerde monster is te laag, de totale hoeveelheid is onvoldoende, of het geëxtraheerde monster is te veel en de lysis is niet volledig;het weefsel of de cellen van geschikte kwaliteit moeten worden gebruikt voor extractie, de voorbehandeling van het monster moet goed worden uitgevoerd en de lysis moet voldoende zijn.
2. Genoomresiduen
Bij extractie met de Trizol-methode, wanneer het supernatant na het aanbrengen in de middelste laag wordt gezogen, zal ernstige genoomverontreiniging worden veroorzaakt;extra voorzichtigheid is geboden bij het aanbrengen van laagjes om te voorkomen dat het in de middelste laag wordt gezogen.Als de kolommethode wordt gebruikt voor extractie, kan een kit met DNase I worden geselecteerd voor extractie.Het nucleïnezuur dat op het membraan wordt geadsorbeerd, wordt direct verteerd met DNase I, wat DNA-residuen aanzienlijk kan verminderen.
3. RNA-afbraak
Het kan de degradatie zijn van het geëxtraheerde monster zelf, of de degradatie veroorzaakt tijdens het extractieproces;voor zover mogelijk moeten verse monsters worden gebruikt voor RNA-extractie, en de verzamelde monsters moeten tijdig worden bewaard in vloeibare stikstof of -80°C koelkast, en herhaaldelijk invriezen en ontdooien moet worden vermeden.Bij het RNA-extractieproces moeten RNase/DNase-vrije tips, centrifugebuisjes en andere materialen worden gebruikt.Het extractieproces moet zo snel mogelijk zijn.Het geëxtraheerde RNA moet op een ijsbox worden geplaatst en bij -80 in de tijd worden bewaard.Als het geëxtraheerde RNA moet worden gedetecteerd door middel van gelelektroforese, moet onmiddellijk na extractie elektroforese worden uitgevoerd en moet de elektroforesebuffer worden vervangen door een nieuw geprepareerde buffer.
4. Zout en residuen van organische oplosmiddelen
De extractiereagentia bevatten fenol- en guanidinezouten en de wasoplossing bevat ethanol.Tijdens het extractieproces werd het lysaat niet volledig geabsorbeerd en weggegooid en was de wasoplossing niet volledig gedroogd.Resterende zouten en organische oplosmiddelen zijn schadelijk voor daaropvolgende reverse transcriptie en PCR.Verschillende graden van remming, dus het weefsellysaat moet tijdens het extractieproces volledig worden verwijderd en het wassen moet voldoende zijn zodat de omringende wanden van de buis kunnen worden gewassen.Bovendien is het legen en blazen van de buis een noodzakelijke stap, waardoor het residu van organisch materiaal verder zal worden verminderd.
Voor meer informatie over RNA-extractie, volg onze website:
www.foreivd.com voor meer informatie.
Posttijd: 01-12-2022
