Moleculaire diagnosetechnologie maakt gebruik van moleculaire biologische methoden om de expressie en structuur van het genetisch materiaal van het menselijk lichaam en verschillende ziekteverwekkers te detecteren, om het doel van het voorspellen en diagnosticeren van ziekten te bereiken.

In de afgelopen jaren is de klinische toepassing van moleculaire diagnostiek met de upgrade en iteratie van moleculaire diagnostische technologie steeds uitgebreider en diepgaander geworden en is de markt voor moleculaire diagnostiek een periode van snelle ontwikkeling ingegaan.

De auteur vat de gangbare moleculaire diagnostische technologieën op de markt samen en is onderverdeeld in drie delen: het eerste deel introduceert de PCR-technologie, het tweede deel introduceert de nucleïnezuur isotherme amplificatietechnologie en het tweede deel introduceert de sequencingtechnologie.

01

Deel I: PCR-technologie

PCR-technologie

PCR (polymerasekettingreactie) is een van de in vitro DNA-amplificatietechnologieën, met een geschiedenis van meer dan 30 jaar.

PCR-technologie werd in 1983 ontwikkeld door Kary Mullis uit Cetus, VS.Mullis vroeg in 1985 een PCR-octrooi aan en publiceerde in hetzelfde jaar het eerste academische PCR-artikel over wetenschap.Mullis won in 1993 de Nobelprijs voor scheikunde.

Basisprincipes van PCR

PCR kan doel-DNA-fragmenten meer dan een miljoen keer versterken.Het principe is dat onder de katalyse van DNA-polymerase de ouderstreng-DNA wordt gebruikt als een sjabloon en een specifieke primer wordt gebruikt als startpunt voor verlenging.Het wordt in vitro gerepliceerd via stappen zoals denaturatie, annealing en verlenging.Het proces van dochterstreng-DNA dat complementair is aan het ouderstreng-template-DNA.

Het standaard PCR-proces is verdeeld in drie stappen:

1. Denaturatie: gebruik hoge temperaturen om dubbele DNA-strengen te scheiden.De waterstofbruggen tussen dubbele DNA-strengen worden verbroken bij hoge temperaturen (93-98°C).

2. Annealing: Nadat het dubbelstrengs DNA is gescheiden, wordt de temperatuur verlaagd zodat de primer kan binden aan het enkelstrengs DNA.

3. Uitbreiding: het DNA-polymerase begint complementaire strengen te synthetiseren langs de DNA-strengen van de gebonden primers wanneer de temperatuur wordt verlaagd.Wanneer de verlenging is voltooid, is een cyclus voltooid en verdubbelt het aantal DNA-fragmenten.

Door deze drie stappen 25-35 keer heen en weer te bewegen, zal het aantal DNA-fragmenten exponentieel toenemen.

Het vernuft van PCR is dat voor verschillende doelwitgenen verschillende primers kunnen worden ontworpen, zodat de fragmenten van het doelwitgen in korte tijd kunnen worden geamplificeerd.

Tot nu toe kan PCR worden onderverdeeld in drie categorieën, namelijk gewone PCR, fluorescerende kwantitatieve PCR en digitale PCR.

De eerste generatie gewone PCR

Gebruik een gewoon PCR-amplificatie-instrument om het doelgen te versterken en gebruik vervolgens agarosegelelektroforese om het product te detecteren, alleen kwalitatieve analyse kan worden uitgevoerd.

De belangrijkste nadelen van de eerste generatie PCR:

- Gevoelig voor niet-specifieke amplificatie en fout-positieve resultaten.

-De detectie duurt lang en de bediening is omslachtig.

-Alleen kwalitatieve testen kunnen worden gedaan.

Tweede generatie fluorescentie kwantitatieve PCR

Fluorescentie kwantitatieve PCR (Real-Time PCR), ook bekend als qPCR, wordt gebruikt om de accumulatie van geamplificeerde producten te bewaken door de accumulatie van fluorescentiesignalen door fluorescerende sondes toe te voegen die de voortgang van het reactiesysteem kunnen aangeven, en om de resultaten te beoordelen via de fluorescentiecurve, en het kan worden gekwantificeerd met behulp van Cq-waarde en standaardcurve.

Omdat de qPCR-technologie wordt uitgevoerd in een gesloten systeem, wordt de kans op besmetting verkleind en kan het fluorescentiesignaal worden gecontroleerd op kwantitatieve detectie, dus het wordt het meest gebruikt in de klinische praktijk en is de dominante technologie in PCR geworden.

De fluorescerende stoffen die worden gebruikt in real-time fluorescerende kwantitatieve PCR kunnen worden onderverdeeld in: TaqMan fluorescerende sondes, moleculaire bakens en fluorescerende kleurstoffen.

1) TaqMan fluorescerende sonde:

Tijdens PCR-amplificatie wordt een specifieke fluorescerende sonde toegevoegd terwijl een paar primers wordt toegevoegd.De probe is een oligonucleotide en de twee uiteinden zijn respectievelijk gelabeld met een fluorescerende reportergroep en een fluorescerende quenchergroep.

Wanneer de sonde intact is, wordt het fluorescerende signaal uitgezonden door de reportergroep geabsorbeerd door de dovende groep;tijdens PCR-amplificatie splitst en degradeert de 5'-3'-exonuclease-activiteit van het Taq-enzym de sonde, waardoor de reporter fluorescerende groep en quencher wordt gemaakt. De fluorescerende groep wordt gescheiden, zodat het fluorescentiebewakingssysteem het fluorescentiesignaal kan ontvangen, dat wil zeggen, elke keer dat een DNA-streng wordt versterkt, wordt een fluorescerend molecuul gevormd en wordt de accumulatie van het fluorescentiesignaal volledig gesynchroniseerd met de vorming van het PCR-product.

2) SYBR fluorescerende kleurstoffen:

In het PCR-reactiesysteem wordt een overmaat SYBR fluorescerende kleurstof toegevoegd.Nadat de SYBR-fluorescerende kleurstof niet-specifiek is opgenomen in de dubbelstrengs DNA, zendt het een fluorescerend signaal uit.Het SYBR-kleurstofmolecuul dat niet in de keten is opgenomen, zal geen fluorescerend signaal afgeven, waardoor het fluorescerende signaal wordt gegarandeerd. De toename van PCR-producten loopt volledig synchroon met de toename van PCR-producten.SYBR bindt alleen aan dubbelstrengs DNA, dus de smeltcurve kan worden gebruikt om te bepalen of de PCR-reactie specifiek is.

3) Moleculaire bakens

Het is een dubbel gelabelde oligonucleotide-probe met stamlus die een haarspeldstructuur vormt van ongeveer 8 basen aan de 5 en 3 uiteinden.De nucleïnezuursequenties aan beide uiteinden zijn complementair gepaard, waardoor de fluorescerende groep en de uitdovende groep strak zijn.Sluit, het zal geen fluorescentie produceren.

Nadat het PCR-product is gegenereerd, wordt tijdens het uitgloeiproces het middelste deel van het moleculaire baken gekoppeld aan een specifieke DNA-sequentie en wordt het fluorescerende gen gescheiden van het quencher-gen om fluorescentie te produceren.

De belangrijkste nadelen van PCR van de tweede generatie:

Er is nog steeds geen gevoeligheid en de detectie van exemplaren met weinig kopieën is niet nauwkeurig.

Er is achtergrondwaarde-invloed en het resultaat is storingsgevoelig.

Derde generatie digitale PCR

Digitale PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) berekent het aantal kopieën van de doelsequentie via eindpuntdetectie en kan nauwkeurige absolute kwantitatieve detectie uitvoeren zonder gebruik te maken van interne controles en standaardcurven.

Digitale PCR maakt gebruik van eindpuntdetectie en is niet afhankelijk van de Ct-waarde (cyclusdrempel), dus de digitale PCR-reactie wordt minder beïnvloed door de amplificatie-efficiëntie en de tolerantie voor PCR-reactieremmers wordt verbeterd, met een hoge nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid.

Vanwege de kenmerken van hoge gevoeligheid en hoge nauwkeurigheid, wordt het niet gemakkelijk verstoord door PCR-reactieremmers en kan het een echte absolute kwantificering bereiken zonder standaardproducten, wat een hotspot voor onderzoek en toepassing is geworden.

Volgens de verschillende vormen van de reactie-eenheid kan deze worden onderverdeeld in drie typen: microfluïdische, chip- en druppelsystemen.