Fluorescentie kwantitatieve PCR (ook bekend als TaqMan PCR, hierna FQ-PCR genoemd) is een nieuwe nucleïnezuur kwantitatieve technologie ontwikkeld door PE (Perkin Elmer) in de Verenigde Staten in 1995. Deze technologie is gebaseerd op conventionele PCR door toevoeging van fluorescerende gelabelde probes.Vergeleken met flexibele PCR heeft FQ-PCR veel voordelen om zijn kwantitatieve functie te realiseren.Dit artikel is bedoeld om kort de kenmerken, principes, methoden en toepassingen van de technologie te beschrijven.
1 Kenmerken
FQ-PCR heeft niet alleen de hoge gevoeligheid van gewone PCR, maar ook vanwege de toepassing van fluorescerende sondes, kan het de verandering van fluorescerend signaal tijdens PCR-versterking direct detecteren via het foto-elektrische geleidingssysteem om kwantitatieve resultaten te verkrijgen, die veel tekortkomingen van conventionele PCR, dus het heeft ook de hoge specificiteit van DNA-hybridisatie en de hoge nauwkeurigheid van spectroscopietechnologie.
Algemene PCR-producten moeten bijvoorbeeld worden geobserveerd door agarosegelelektroforese en ethidiumbromidekleuring met ultraviolet licht of door polyacrylamidegelelektroforese en zilverkleuring.Dit vereist niet alleen meerdere instrumenten, maar kost ook tijd en moeite.De gebruikte kleurstoffen Ethidiumbromide is schadelijk voor het menselijk lichaam en deze gecompliceerde experimentele procedures bieden mogelijkheden voor vervuiling en valse positieven.FQ-PCR hoeft het deksel echter maar één keer te openen tijdens het laden van het monster, en het daaropvolgende proces is een volledig gesloten buis, waarvoor geen PCR-nabewerking nodig is, waardoor veel nadelen bij conventionele PCR-bewerkingen worden vermeden.Het experiment maakt over het algemeen gebruik van de ABI7100 PCR thermal cycler, ontwikkeld door PE Company.
Het instrument heeft de volgende kenmerken: ① Brede toepassing: het kan worden gebruikt voor DNA- en RNA-PCR-productkwantificering, onderzoek naar genexpressie, detectie van pathogenen en optimalisatie van PCR-omstandigheden.② Uniek kwantitatief principe: met behulp van fluorescent gelabelde sondes zal de hoeveelheid fluorescentie zich ophopen met de PCR-cyclus na laserexcitatie, om het doel van kwantificering te bereiken.③ Hoge werkefficiëntie: ingebouwde 9600 PCR thermische cycler, computergestuurd 1 tot 2 uur om de amplificatie en kwantificering van 96 monsters automatisch en synchroon te voltooien.④ Geen behoefte aan gelelektroforese: het is niet nodig om het monster te verdunnen en te elektroforese, gebruik gewoon een speciale sonde om direct in de reageerbuis te detecteren.⑤Geen vervuiling in de pijpleiding: de unieke, volledig gesloten reactiebuis en het foto-elektrische geleidingssysteem worden gebruikt, dus u hoeft zich geen zorgen te maken over vervuiling.⑥De resultaten zijn reproduceerbaar: het kwantitatieve dynamische bereik is maximaal vijf ordes van grootte.Daarom is deze technologie, sinds deze met succes is ontwikkeld, door veel wetenschappelijke onderzoekers gewaardeerd en op veel gebieden toegepast.
2 Principes en methoden
Het werkingsprincipe van FQ-PCR is om de 5'→3'-exonuclease-activiteit van het Taq-enzym te gebruiken om een fluorescerend gemerkte probe aan het PCR-reactiesysteem toe te voegen.De probe kan specifiek hybridiseren met de DNA-matrijs die in de primersequentie aanwezig is.Het 5'-uiteinde van de sonde is gelabeld met het fluorescentie-emissiegen FAM (6-carboxyfluoresceïne, fluorescentie-emissiepiek bij 518 nm), en het 3'-uiteinde is gelabeld met de fluorescentie-uitdovende groep TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, fluorescentie-emissiepiek bij 582 nm), het 3'-begin van de sonde is gefosforyleerd om te voorkomen dat de sonde wordt verlengd tijdens PCR-amplificatie.Wanneer de sonde intact blijft, onderdrukt de quenchergroep de fluorescentie-emissie van de emitterende groep.Zodra de emitterende groep is gescheiden van de dovende groep, wordt de remming opgeheven en neemt de optische dichtheid bij 518 nm toe en wordt gedetecteerd door het fluorescentiedetectiesysteem. In de renaturatiefase hybridiseert de sonde met het sjabloon-DNA en beweegt het Taq-enzym in de verlengingsfase langs de DNA-sjabloon met de verlenging van de primer.Wanneer de sonde wordt afgesneden, wordt het dovende effect vrijgegeven en wordt het fluorescentiesignaal vrijgegeven.Elke keer dat de sjabloon wordt gekopieerd, wordt een sonde afgesneden, vergezeld van het vrijgeven van een fluorescerend signaal.Aangezien er een één-op-één-relatie bestaat tussen het aantal vrijgegeven fluoroforen en het aantal PCR-producten, kan deze techniek worden gebruikt om de sjabloon nauwkeurig te kwantificeren.Het experimentele instrument gebruikt over het algemeen de ABI7100 PCR thermische cycler ontwikkeld door PE company, en andere thermische cyclers kunnen ook worden gebruikt.Als het reactiesysteem van het ABI7700-reactietype wordt gebruikt voor het experiment, kunnen de kwantitatieve resultaten direct worden gegeven via computeranalyse nadat de reactie is voltooid.Als u andere thermische cyclers gebruikt, moet u een fluorescentiedetector gebruiken om tegelijkertijd het fluorescentiesignaal in de reageerbuis te meten om RQ+, RQ-, △RQ te berekenen.RQ+ vertegenwoordigt de verhouding van de luminescentie-intensiteit van de fluorescentie-emissiegroep van de monsterbuis tot de luminescentie-intensiteit van de dovende groep, RQ- vertegenwoordigt de verhouding van de twee in de blanco buis, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) vertegenwoordigt de hoeveelheid fluorescentiesignaalverandering tijdens PCR. Na gegevensverwerking kunnen kwantitatieve resultaten worden verkregen.Door de introductie van fluorescerende sondes is de specificiteit van het experiment aanzienlijk verbeterd.Het ontwerp van de sonde moet over het algemeen aan de volgende voorwaarden voldoen: ①De lengte van de sonde moet ongeveer 20-40 basen zijn om de specificiteit van de binding te waarborgen.②Het gehalte aan GC-basen ligt tussen 40% en 60% om duplicatie van afzonderlijke nucleotidesequenties te voorkomen.③ Vermijd hybridisatie of overlap met primers.④ De stabiliteit van de binding tussen de probe en de template is groter dan de stabiliteit van de binding tussen de primer en de template, dus de Tm-waarde van de probe moet minstens 5°C hoger zijn dan de Tm-waarde van de primer.Bovendien hebben de concentratie van de probe, de homologie tussen de probe en de templatesequentie en de afstand tussen de probe en de primer allemaal invloed op de experimentele resultaten.
Gerelateerde producten:
China Realtime PCR Easyᵀᴹ-Taqman Fabrikant en leverancier |Foregene (foreivd.com)
Posttijd: 15 oktober 2021
