Directe PCR is een reactie waarbij direct dierlijke of plantaardige weefsels worden gebruikt voor amplificatie zonder extractie van nucleïnezuur.In veel opzichten werkt directe PCR als gewone PCR

Het belangrijkste verschil is de aangepaste buffer die wordt gebruikt bij directe PCR, het monster kan direct worden onderworpen aan de PCR-reactie zonder nucleïnezuurextractie, maar er zijn overeenkomstige vereisten voor de tolerantie van de enzymen en de compatibiliteit van de buffer die betrokken is bij de directe PCR-reactie.

Hoewel er min of meer PCR-remmers in gewone monsters zitten, kan directe PCR nog steeds een betrouwbare amplificatie bereiken onder invloed van enzymen en buffers.De traditionele PCR-reactie vereist nucleïnezuur van hoge kwaliteit als sjabloon, wat de soepele voortgang van de PCR-reactie kan remmen als de sjabloon eiwitten en andere onzuiverheden bevat.Directe PCR is momenteel een van de meer populaire technologieën op het gebied van moleculaire diagnostiek.

01 Directe PCR werd oorspronkelijk gebruikt voor dieren en planten

De vroegste toepassing van directe PCR is op het gebied van dieren en planten, zoals het bloed, weefsel en haar van de rat, kat, kip, konijn, schaap, vee, enz., plantenbladeren en -zaden, enz., gebruikt om genotypering, transgeen, plasmidedetectie, gen-knock-outanalyse, DNA-bronidentificatie, soortidentificatie, SNP-analyse en andere gebieden te bestuderen.

Deze velden hebben enkele gemeenschappelijke kenmerken, dat wil zeggen dat het doelgengehalte relatief hoog is en nucleïnezuurextractie lastig is, dus directe PCR kan niet alleen tijd besparen en een kleine invloed hebben op de resultaten, maar ook kosten besparen.

Directe PCR die wordt gebruikt voor de detectie van ziekteverwekkers is een kwestie van de laatste jaren, sommige fabrikanten van PCR-reagens hebben veel inspanningen geleverd in deze richting bij het maken van innovatie.Vooral in deze COVID-19-epidemie zijn veel van dergelijke detectieproducten op de markt verschenen, zoals de SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method), onderzocht en ontwikkeld door Foregene, die gebruik maakt van Real-time RT PCR-technologie (rRT-PCR) voor kwalitatieve detectie van SARS-CoV-2-nucleïnezuren in menselijke nasofaryngeale of orofaryngeale uitstrijkjes.

Foregene is een van de bedrijven die Direct PCR-technologie gebruikt voor de detectie van normale ORF1ab, N, E envariant lineages nucleïnezuren in humane nasofaryngeale of orofaryngeale uitstrijkjes zoals SARS-CoV-2 B.1.1.7 lineage (VK), B.1.351 lineage (ZA), B.1.617 lineage (IND) en P.1 lineage (BR).

02  Reagentia nodig voor directe PCR

Monster Lysaat

Het monsterlysaat kan door uzelf worden geconfigureerd of worden gekocht.Het verschil in de samenstelling van verschillende merken lysaat zal het lyserende vermogen anders maken, en dan zal de lysatietijd iets anders zijn.Voor de bereiding van monsters van dierlijk weefsel wordt bijvoorbeeld in het algemeen 30 minuten of een nachtelijke lysis aanbevolen, en de lysisoplossing voor virussen varieert van 3-10 minuten.

PCR-mastermix

Het wordt aanbevolen om hot-start DNA-polymerase te gebruiken om specifieke amplificatie te verbeteren en het amplificatievermogen te vergroten.De kern van directe PCR is een zeer tolerante polymerase.

Elimineer of rem componenten in het monster die de DNA-amplificatie beïnvloeden

Nadat het monster is verwerkt met het lysaat, zullen eiwitten, lipiden en ander celafval vrijkomen, deze stoffen zullen de PCR-reactie remmen.Daarom vereist directe PCR de toevoeging van overeenkomstige verwijdering of remmers om de invloed van deze factoren te verminderen.

03  Een verzameling van vijf kennispunten van directe PCR

Ten eerste is Direct PCR-technologie een directe PCR-technologie voor verschillende biologische monsters.Onder deze technische voorwaarde is het niet nodig om het nucleïnezuur te scheiden en te extraheren, het weefselmonster direct als object te gebruiken en de doelgenprimers toe te voegen om de PCR-reactie uit te voeren.

Ten tweede is Direct PCR-technologie niet alleen een traditionele DNA-template-amplificatietechnologie, maar omvat ook RNA-template reverse transcriptie-PCR.

Ten derde voert Direct PCR-technologie niet alleen rechtstreeks routinematige kwalitatieve PCR-reacties uit op weefselmonsters, maar omvat ook real-time qPCR-reacties, waarvoor het reactiesysteem een ​​sterk anti-achtergrondfluorescentie-interferentievermogen moet hebben en endogene fluorescentie-uitdovers het antagonistische vermogen.

Ten vierde hebben de monsters die het doelwit zijn van de Direct PCR-technologie alleen de afgifte van nucleïnezuurtemplates nodig en verwijderen ze geen eiwitten, polysacchariden, zoutionen, enz. Die de PCR-reactie verstoren.Dit vereist dat de nucleïnezuurpolymerase en PCR-mix in het reactiesysteem een ​​uitstekende weerstand en aanpassingsvermogen hebben om enzymactiviteit en replicatienauwkeurigheid onder complexe omstandigheden te garanderen.

Ten vijfde is het weefselmonster waarop Direct PCR-technologie is gericht zonder enige behandeling met nucleïnezuurverrijking en de hoeveelheid sjabloon erg klein, wat vereist dat het reactiesysteem een ​​extreem hoge gevoeligheid en amplificatie-efficiëntie heeft.